Производство протеина: Производство протеина как бизнес. Технологии производства сывороточного протеина :: BusinessMan.ru

Содержание

Производство протеина как бизнес. Технологии производства сывороточного протеина :: BusinessMan.ru

Бум производства протеина пришелся на 90-е годы, когда были доказаны и оглашены его высокие анаболические свойства и биодоступность. На сегодняшний день это самая востребованная биодобавка не только среди спортсменов, но и обычных людей. Протеин (англ. protein – белок) – это чистый белок, который легко и практически без остатка усваивается организмом. Это концентрированный порошок, который стимулирует внутриклеточный белковый синтез, необходимый для мышечного роста. При этом протеин используется даже для похудения. При белковой диете с использованием протеина происходит сжигание жира без вреда мышцам, человек не чувствует упадка сил, а метаболизм сохраняется на высоком уровне.

Виды протеина и тенденции рынка

Современные заводы по производству протеина выпускают четыре основных его вида:

  • Сывороточный (Whey Protein).
  • Соевый (Soy Protein).
  • Казеин (Casein protein).
  • Яичный протеин (Egg Protein).

Все это диетические, натуральные, 100% усваиваемые высокобелковые продукты из органического сырья с низким содержанием жиров и углеводов.

Последняя тенденция рынка белковых пищевых добавок – это объединение нескольких белковых препаратов в одном продукте. Один из вариантов — комбинирование сывороточного протеина с казеином. Последний медленно усваивается организмом и служит источником аминокислот для крови долгое время. Комбинация казеина и сывороточного протеина подходит как для дневного приема, так и перед сном. Это дает возможность избежать катаболизма, который может быть спровоцирован длительным перерывом между приемами пищи в связи со сном.

В последнее время при производстве протеина в конечный продукт на основе сывороточного белка все чаще стали добавлять соевый концентрат. Он усваивается также быстро и содержит большое количество глютамина, аргинина и аминокислот ВСАА (комплекс из трех аминокислот с разветвленными цепочками). Кроме этого, соевый протеин ускоряет восстановление.

Включение в состав белковых препаратов яичного протеина, который полностью лишен углеводов, повышает активность процессов секреции анаболических гормонов.

И все же, проведя ряд сравнительных анализов, исследователи определили лучшим белковым продуктом для стимулирования внутриклеточного белкового синтеза и роста мышц сывороточный протеин.

Сывороточный протеин

Это концентрированный белок, который выделяют из молочной сыворотки. В состав входят альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин, глобулярные белки и около 8 % сывороточного альбумина. Проще говоря, этот пищевой концентрат — «полноценный» белок, в котором также присутствуют в большом количестве необходимые организму аминокислоты – валин, лейцин и изолейцин (комплекс ВСАА). Это важные «строительные» блоки мышечной ткани, без которых невозможен белковый синтез и мышечный рост.

Сывороточный протеин исключительно быстро, легко и без остатка усваивается организмом. Этот продукт соответствует высшему коэффициенту биологической активности – показателю, определяющему количество усвоенного протеина из съеденного объема. Медицинские исследования доказали общую полезность сывороточного протеина для здоровья. Его употребление стимулирует сопротивляемость организма некоторым раковым заболеваниям, нормализует кровяное давление, укрепляет иммунную систему.

Производство

Жидкая сыворотка относится к побочным продуктам производства, связанного со свертыванием молока (напр. сыроварение). Содержание в сыворотке белка ничтожно мало, и долгое время этот сопутствующий продукт попросту относили к отходам и сливали в канализацию. Только спустя многие десятилетия развитие технологий позволило наладить производство протеина на оборудовании, позволяющем выделять протеин из сыворотки в промышленных количествах.

Технология выделения белка из сыворотки включает несколько этапов. Изначально осуществляется процесс сворачивания молока, происходит отделение творога и сыворотки. Содержание минералов, лактозы, лактальбумина в полученной первоначальной сыворотке не превышает 5 %. На следующем этапе жидкий продукт пастеризуется и фильтруется. Далее отфильтрованный сывороточный протеин концентрируется и сушится. Получаемый на выходе продукт содержит от 60 до 97 % белка. Производство сывороточного протеина — достаточно сложный процесс, который не возможен в домашних условиях.

Концентрат сывороточного протеина (WPC)

При выделении любого вида протеина фильтрация является неотъемлемой и одной из важнейших процедур. При производстве протеина сыворотка пропускается через определенное сито, на котором задерживаются белковые фракции.

Первой технологией получения концентрированного белкового продукта была фильтрация сыворотки через керамические мембраны с очень мелкими отверстиями. Несмотря на невообразимо малый размер, через такие отверстия свободно проходят молекулы жиров и углеводов, но оседают более крупные по размеру белковые фракции. Собранный с мембраны сывороточный протеин отправлялся под высокую температуру для высыхания до состояния белкового порошка.

Недостатком концентрата сывороточного протеина является чистота фильтрации. Технически невозможно получать отверстия в мембране одинакового сечения, поэтому оседает смешанная масса, в которой доля протеина 35-8 5%, притом что честные производители поддерживают содержание протеина в своих продуктах на уровне не менее 70-80 %. Как следствие, концентрат не является самым чистым белковым продуктом, в его составе могут содержаться излишние углеводы и жиры, что может привести к избыточному газообразованию в организме. Сывороточный концентрат — хороший выход при ограниченном финансировании производства, потому самый дешевый на рынке. Белковые фракции протеина, полученного по данной технологии, сохраняют все свои полезные свойства.

Изолят сывороточного протеина (WPI)

Изолят протеина – значительно более чистый продукт. Его получают путем продолжительной фильтрации, называемой также ионным обменом. В результате получается сухая масса с содержанием белковой фракции до 95 %. Сывороточный изолят практически не содержит жиров и углеводной лактозы, идеален для приема. Очень часто производители используют в готовом продукте смесь изолята и концентрата, что позволяет значительно удешевить готовую смесь, но при этом содержание сывороточного белка не превышает 70 %. Специалисты рекомендуют внимательно читать информацию на этикетке и выбирать продукт, в котором главным компонентом является изолят.

Гидролизат сывороточного белка (WPH)

Производство протеина методом гидролиза, при котором крупные белковые молекулы делятся на отдельные фрагменты. Подобный процесс происходит в пищеварительном тракте и отнимает у организма немало энергии. Гидролизат белка снимает такую необходимость в организме, получаемый протеин усваивается немедленно. Некоторые эксперты считают, что при восстановлении мышц необходимо принимать только гидролизат, хотя стоит учитывать, что это наиболее дорогая разновидность протеина. Стоит отметить, что возможности современного оборудования позволяют настраивать гидролиз таким образом, что содержание мелких белковых фракций может быть лишь 3-50 %. Это может значительно удешевить себестоимость продукта. При малом содержании мелких фрагментов такой протеин горчит.

Методы фильтрации

Производство сывороточного протеина, прежде всего, предусматривает фильтрацию молочной сыворотки от лактозы и жиров по одной из следующих технологий:

  • Ультрафильтрация – пропускание сыворотки через крайне мелкие отверстия керамической мембраны под большим давлением. На мембране оседают большие белковые фракции, которые отправляются на дальнейшую переработку.
  • Микрофильтрация – метод дополнительной фильтрации полученной в результате ультрафильтрации белковой массы при низкой температуре. Благодаря микрофильтрации удается дополнительно отсеять молекулы жира, снизив их содержание в белковой массе от 1 % и более.
  • Ионный обмен. Для отделения молекул белка от лактозы, жира и других компонентов в жидкую сыворотку вводят заряженные ионы, которые связываются только с протеином. Далее, используя разность потенциалов, через ионы выделяют белок. К недостаткам такого метода фильтрации относятся: потеря части полезных фракций и попадание промежуточных химикатов в готовый продукт.
  • Гидролиз – химический процесс расщепления крупных молекул белка на мелкие части, которые называются пептидами и быстро усваиваются организмом.

Протеин российского производства

Российские образцы протеина появились в продаже относительно недавно. До этого времени, в том числе и Советском Союзе, источниками питательных веществ для спортсменов были в основном натуральные продукты: яйца, молоко, творог, рыба, говядина, злаковые и бобовые. При этом их спортивные показатели достигали иногда легендарного уровня.

Активное производство протеина в России началось с повышением лояльности в требованиях к качеству продуктов питания, в том числе и спортивного питания, употребление которого стало стремительно набирать обороты. Сейчас протеин отечественного производства постепенно набирает популярность и на мировом уровне. Среди самых известных брендов: «Геркулес», ATech, PureProtein, Ironman, LadyFitness. Возможно, в недалеком будущем российские бренды будут конкурировать с такими известными и старейшими корпорациями по производству протеина, как Optimum Nutrition.

Технология производства сывороточных белков

При производстве сыра молоко подвергают закисанию, при этом сворачивается основной протеин молока, казеин, превращаясь вместе с жиром в так называемое сырное зерно. Оно подвергается дальнейшей обработке в сыроделии. Оставшийся продукт называется сывороткой. В среднем на каждую тонну сыра приходится примерно восемь тонн сыворотки.Сыворотка является смесью, масса сухих веществ составляет примерно 6,5%. 
Чтобы использовать сыворотку в качестве высокоценного продукта, следует разделить отдельные компоненты и изготовить концентрат. Возникает, прежде всего, концентрат протеина сыворотки (WPC) и концентрат лактозы. 
Концентрат протеина сыворотки (Whey Protein Concentrate) используется благодаря своей питательности и полезным свойствам в качестве пищевого продукта. Получающаяся при этом лактоза также находит применение в пищевой или фармацевтической промышленности.

Существует четыре типа фильтрации: 

При мембранной фильтрации мембрана служит для задержки крупных молекул. При часто используемом методе поперечного течения осадок (то есть то, что удерживает мембрана) направляется поперечно мембране и тем самым препятствует её засорению. Использование перепада давления ( трансмембранное давление ) приводит в движение жидкость и гонит её вместе с мелкими молекулами , всё вместе называется пермеат , через мембрану. Выбирая мембрану, можно регулировать, какие молекулы пройдут, а какие будут задержаны. Мембраны различаются по материалам, из которых они сделаны (полимеры, керамика, высококачественная сталь) , способу упаковки (полое волокно, обмоточные и панельные модули) и величине пор.

По величине пор различаются четыре типа фильтрации : 
• микрофильтрация (MF: 0,05 до 10 μm) 
• ультрафильтрация (UF: 1 kDa до 500 kDa) 
• нанофильтрация (NF:150 до 1000Da) 
• обратный или реверсный осмос (RO: < 150 Da) 

Единица Далтон (Da) равнозначна единице атомной массы и служит в мембранной технике для обозначения величины пор или разделителей . Обычно для сыворотки применяются ультрафильтрационные обмоточные модули с величиной пор 10 kDa, чтобы концентрировать протеины сыворотки . На втором этапе в процессе нанофильтрации с мембраной 150-kDa удерживается лактоза. В заключение при помощи обратного осмоса отделяются оставшиеся соли, получается чистая вода.

Производство сывороточного протеина

Современные спортсмены знают точно, где купить протеин сывороточный изолят, и для чего он необходим. Производится эта концентрированная смесь из молочной сыворотки и является дополнительным продуктом при изготовлении сыра.

Производство и состав протеина

После того, как молоко сворачивается, образовывается сыворотка. В ней содержатся минералы, лактальбумин и раствор лактозы. Изначально жир снимается, а после он обрабатывается до состояния пригодности его применения в пищу. Обработка продукта возможна с помощью простого высушивания или же удаления липидов и прочих веществ. Также сыворотку можно денатурировать, превращая ее в белковый гель. Состоит сывороточный протеин из белков. Те в свою очередь состоят из сыворотки и казеина. Главные элементы белкового характера: иммуноглобулины, альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, сывороточный альбумин.

Формы протеина

Зачастую протеин поставляется в нескольких формах: изолят, концентрат и гидролизат. В концентрате содержится небольшое количество жиров и холестерина. А доля лактозы может составлять от 29 до 89%. Этот вид спортпита самый дешевый на современном рынке. Изолят подвержен тщательной очистке. Он более чист и содержит биоактивные вещества от 90%. В нем практически нет жиров и лактозы. Данный продукт полезен для пополнения дефицита аминокислот до тренировки и после нее. А вот гидролизаты – белки, которые довольно быстро усваиваются организмом, но являются более дорогими по стоимости. Такая сыворотка менее всего аллергенна и горьковата на вкус. Именно данный показатель может говорить о качестве самого продукта.

Способ микрофильтрации

Некоторые сывороточные изоляты удаются при помощи микрофильтрации. Современный прогресс давно не стоит на одном месте, а потому производители научились делать уникальный продукт с использованием технологий перекрестной микрофильтрации, мембранной и сверх фильтрации, нано и микрофильтрации, поточной хроматографии. Микрофильтрация является одним из самых актуальных и популярных методов. Перекрестная микрофильтрация – различные варианты обработки белков при помощи очистки концентрата с использованием низких температур. В итоге получается специализированный продукт, содержащий не менее 90% белков с наличием полезных субфракций, а также низкого уровня лактозы и жира. В нем также отсутствует неденатурированный белок. Микрофильтрация – это способ, во время которого применяют высокотехнологичное фильтрование. Это отличает его от ионного обмена с использованием катализатора химической реакции. В таком сывороточном протеине содержится максимум кальция и минимум натрия.

Оптимальный вариант протеина для бодибилдинга

На сегодняшний день оптимальным вариантом протеина для бодибилдеров является именно изолят. Он способен быстро снабдить организм человека необходимыми аминокислотами, являясь важнейшим материалом для роста сухой мышечной массы. Культуристы во всем мире используют сывороточный изолят в качестве дополнительного специализированного продукта к основному питанию, строя свою спортивную диету. Изолят от известнейших мировых производителей непременно станет лучшим выбором для современных спортсменов. Атлеты точно знают, что повышенное содержание кальция связано напрямую с процессами смещения метаболизма в сторону активного расщепления жиров и снижения жирообразования. Добавляя к своему ежедневному рациону такой спортпит, спортсмен получает продукт, который способствует ускорению процессов метаболизма, а также укреплению костных тканей и набору мышечной массы.

В Воронежской области открыли уникальный завод по переработке молочной сыворотки

В Воронежской области во вторник, 17 декабря, запустили производство по переработке молочной сыворотки. Предприятие в Калачеевском районе открыла компания «Молвест». Этот завод – первый в регионе и уникальный для страны. Что в нём особенного – в сюжете «Вести Воронеж».

Стальные сосуды и трубы – своего рода гигантский фильтр. Молочную сыворотку сначала очищают в два этапа, уже после сушат.

– Из литра молока мы получаем на заводе 100 г сыра, а остальное – это сыворотка. И в этой сыворотке 5% содержания сухих веществ. Принцип работы этих мембранных установок – выделить эти 5%, а остальную влагу удалить, – объяснил начальник цеха предприятия Иван Никитенко.

Таким образом здесь получают концентрат сывороточного белка и другие продукты глубокой переработки. Эти продукты используют для производства спортивного и диетического питания, кондитерских, хлебобулочных изделий.

Всего на предприятии сейчас производят три вида продукции из молочной сыворотки. Самая богатая белком – КСБ 80%. Концентрат будут применять для изготовления спортивного и диетического питания. Попробовать его можно и сейчас. На вкус он, правда, безвкусный.

Пользу молочной сыворотки люди долго недооценивали. Использовали поначалу только в качестве корма для животных.

– В молочной сыворотке есть масса полезных веществ и главный из них – это белок, который очень быстро усваивается в организме человека, – отметил генеральный директор компании «Молвест» Анатолий Лосев.

Почти половина этого сырья в нашей стране пока – импорт. На предприятии говорят, будут производить минимум 600 тонн продукции в день – она уже продана на полгода вперёд. Старт производству дал губернатор Александр Гусев.

– Технология для России новая, не отработанная. Рынок сбыта уже привык, наверное, к иностранным продуктам, поэтому продвигаться он может не просто. Поэтому можете рассчитывать на поддержку правительства Воронежской области, – заверил глава региона.

Технологию позаимствовали в Европе – оно автоматизированное. Операторы следят за производством от его начала до фасовки, не вмешиваясь в процесс. При этом тут создали почти полсотни рабочих мест.

– Немаловажно то, что в районном центре построено такое технологическое предприятие. Это рабочие места, вливание инвестиций в экономику районов области, – добавил депутат Государственной думы РФ Аркадий Пономарёв.

В планах компании «Молвест» – развивать этот вид производства. Например, перерабатывать молочную сыворотку, в том числе, для фармацевтической сферы.

Как развивалось производство протеина из природного газа

Еще в 60-х годах прошлого века ученые начали рассматривать возможность применения биомассы, состоящей из бактерий, окисляющих природный газ. Полученное из них сырье было решено использовать в качестве одного из элементов питания животных и людей. Одновременно с этим начались исследования возможности добычи белкового сырья из углеводородных материалов природного происхождения — нефти и газа.

В результате метанокисляющая бактерия подверглась тщательному изучению. К 1964 году были заложены первые основы технологии производства белка, который может использоваться при создании кормов для сельскохозяйственного скота, из нефти, природного газа, иных видов топлива, имеющих природное происхождение.

Как развивалась технология

Спустя несколько лет к советским исследованиям присоединилась Германия. Соглашение о разработке совместной технологии было подписано правительствами двух государств, в рамках договоренности — разработана программа, которая должна была действовать на протяжении 20 лет.

Ожидалось, что результатом действия такой программы станет формирование на территории двух государств производств кормового белка из дизельного топлива и природного газа. На советской территории первая опытная установка по производству такого белка была запущена в 1983 году. После многократных испытаний, протекавших на протяжении двух лет, установка была настроена на массовое производство белка.

Со своими задачами установка для производства микроорганизмов в газовой среде справлялась вполне успешно — на экспорт и в хозяйства на территории России в период с 1988 по 1994 год отправилось 40 тысяч тонн такого белка.

В период с 1991 по 1992 год по политическим причинам внимание от увеличения мощностей выпуска биопротеина из природного газа было отвлечено. С мая 1994 года его полностью остановили.

Современное состояние технологии

В настоящее время ведутся работы по совершенствованию технологии добычи протеина из природного газа. Используются современные технологии, которые не были доступны на производствах советского периода. Это позволило улучшить итоговое качество продукции и вновь запустить производство сельскохозяйственных кормов на основе биопротеина, полученного из природного газа. Кроме того, данное сырье активно применяется в процессе производства концентратов для пищевой промышленности, косметической, фармацевтической отраслей.

Продукты сывороточного протеина – концентрат, изолят, гидролизат – в чем разница?

Сывороточный протеин – это высококачественный диетарный источник протеина, поэтому не удивительно, что он очень популярен как протеиновая пищевая добавка. Часто спрашивают, в чем разница между различными порошками сывороточного протеина, которые встречаются на рынке пищевых добавок, и какой же из них можно назвать «наилучшим». Существуют различные виды сывороточного протеина: концентраты, изоляты, микрофильтрованные изоляты, ионообменные изоляты и гидролизаты. Так давайте же разберемся с ними раз и навсегда.

Введение

Сывороточный протеин является одним из двух главных молочных протеинов (второй – это казеин). Производство этого протеина заключается в том, что сыворотка отделяется от молока, а затем она проходит процесс обработки (такой как ультрафильтрация, микрофильтрация, ионный обмен и обратный осмос), в результате чего получаются различные продукты сывороточного протеина.

Сегодня на рынке пищевых добавок существуют такие продукты сывороточного протеина, как концентраты, сывороточный протеин с низким содержанием лактозы, изоляты и гидролизаты. Каждый продукт сывороточного протеина отличается количеством содержащегося в нем протеина, углеводов (лактозы), жиров, минералов и таких специфических биоактивных протеинов, как альфа-лактоглобулин, бета-лактоглобулин, иммуноглобулины, гликомакропептиды, альбумин бычьей сыворотки, лактоферрин и лактопероксидаза.

Положительные эффекты

Подробный обзор всех положительных эффектов сывороточного протеина в сравнении с другими протеинами, такими как казеин, яичный и соевый протеины – это тема для отдельной статьи. А здесь я лишь кратко опишу его некоторые полезные свойства.

Сывороточный протеин – это богатый источник высоко биодоступных незаменимых аминокислот (особенно лейцина). Между прочим, сывороточный протеин был признан идеальным источником протеина на основании его великолепного аминокислотного профиля и высокой усваиваемости. Кроме того, этот протеин имеет несколько дополнительных интересных эффектов, которые представляют особенную ценность для атлетов и физически активных людей.

В ходе одного исследования ученые сравнивали две диеты, которые включали в себя либо сывороточный протеин, либо казеин и одинаковое количество углеводов. В результате было обнаружено, что в отличие от казеина сывороточный протеин увеличивал запасы гликогена в мышцах и печени. Кроме того, сывороточный протеин – это богатый источник серосодержащей аминокислоты цистеин. Этот факт заслуживает внимания, поскольку цистеин является ключевой ограничивающей аминокислотой для синтеза глютатиона, а диетарный цистеин считается ограничивающим скорость субстратом для данного синтеза. Глютатион – это мощный антиоксидант, который также необходим для пролиферации лимфоцитов и поддержания иммунной функции. Сильно не вдаваясь в подробности, отмечу, что имеются свидетельства того, что увеличенный уровень глютатиона (посредством изменения так называемого состояния окисления-восстановления) может изменять экспрессию генов в сторону мышечного роста. Фактически было обнаружено, что потребление концентрата сывороточного протеина вызывает увеличение уровня глютатиона в тканях, а также то, что иммуностимулирующий эффект этого протеина в основном можно приписать его способности повышать уровень глютатиона.

В ходе другого очень интересного исследования ученые изучали эффекты потребления 20 граммов в день концентрата сывороточного протеина в течение трех месяцев. В результате было обнаружено, что потребление концентрата сывороточного протеина существенно повышало лимфоцитный уровень глютатиона – на 35%, а также увеличивало пиковую мощность и 30-секундную максимальную работоспособность. Кроме того, у испытуемых, потреблявших концентрат сывороточного протеина, наблюдалось снижение уровня подкожного жира с одновременным сохранением веса тела! Эти результаты определенно имеют ценность для атлетов и физически активных людей, которые стремятся улучшить здоровье и привести себя в форму.

Концентраты сывороточного протеина против изолятов

Изолят сывороточного протеина обладает высокой концентрацией протеина (90-95%) и содержит очень небольшое количество (если вообще содержит) жиров, лактозы и минералов. Содержание протеина в концентрате сывороточного протеина может разниться в пределах 25-89%. Однако большинство таких концентратов содержат 80% протеина. Также они содержат некоторое количество лактозы, жиров и минералов. Другое главное различие между изолятами и концентратами сывороточного протеина заключается в том, что изоляты практически не содержат лактозы и стоят гораздо дороже.

Микрофильтрованные изоляты сывороточного протеина

Существует несколько различных способов микрофильтрации. Все они применяются с целью обогащения (или концентрирования) различных субфракций сывороточного протеина.

К популярным технологиям микрофильтрации относятся микрофильтрация Cross Flow (CFM®), ультрафильтрация (UF), обратный осмос (RO), динамическая мембранная фильтрация (DMF), ионообменная хроматография (IEC), электроультрафильтрация (EU), радиальнопоточная хроматография (RFC) и нанофильтрация (NF).

Технологии микрофильтрации позволяют производить порошки высококачественного (неденатурированного) протеина с очень высоким протеиновым содержанием (>90%). Микрофильтрованный сывороточный протеин сохраняет в себе важные субфракции и содержит лишь небольшое количество жиров и лактозы, поэтому он определенно достоин своей высокой цены.

Гидролизованные протеины

Помимо этого существует гидролизованный сывороточный протеин (также называемый гидролизованными сывороточными пептидами). Слово «гидролизованный» означает, что посредством технологических процессов этот протеин был расщеплен на более мелкие цепочки аминокислот, называемые пептидами. Гидролитический процесс имитирует наши собственные пищеварительные акции. Таким образом, можно сказать, что гидролизованный протеин – это предварительно переваренный протеин. Такой протеин содержит в основном дипептиды и трипептиды, абсорбируется быстрее по сравнению с аминокислотами в свободной форме и гораздо быстрее, чем интактные (негидролизованные) протеины.

Потреблять гидролизат сывороточного протеина предпочтительнее в виде послетренировочных коктейлей (и перед силовыми тренировками), потому что он способствует более быстрому увеличению концентраций аминокислот в крови и усилению отклика инсулина в течение двух-трех часов. Одновременное повышение уровней аминокислот и инсулина в крови в свою очередь способствует синтезу мышечного протеина и препятствует его разрушению.

Особенно интересно то, что потребление растворов протеинового гидролизата (которые также содержат 15 грамм глюкозы) вызывает резкое повышение концентрации инсулина в крови, уровень которого становится в два и четыре раза выше, чем после потребления растворов с молоком и глюкозой (15 грамм глюкозы растворенной в воде) соответственно. И это несмотря на тот факт, что в исследовании, где были получены эти результаты, содержание углеводов в используемой дозе молока было превышено практически в три раза.

Таким образом, при потреблении протеинового гидролизата в качестве послетренировочного коктейля (и перед тренировкой с отягощениями) создается мощный отклик уровней аминокислот и инсулина в крови, что устраняет необходимость потреблять большие объемы углеводов и ненужных калорий. Другое практическое преимущество заключается в том, что протеиновый гидролизат можно потреблять сразу после тренировки, не боясь сильно подавить аппетит, поэтому после такого коктейля можно сделать еще один прием пищи, тем самым оптимизируя послетренировочное «анаболическое окно». Кроме того, вы когда-нибудь сталкивались с такой неприятной ситуацией, когда протеиновые порошки забивали шейкер? Если да, то теперь у вас есть дополнительная причина использовать порошковый сывороточный протеин с гидролизатами, потому что гидролизаты увеличивают растворимость продукта.

Таким образом, очевидно, что гидролизованный сывороточный протеин – это самый популярный протеиновый коктейль среди атлетов.

Заключение

Подведем итоги: если вы не переносите лактозу вообще, то выбирайте изолят сывороточного протеина. Если вы все же можете переносить небольшое количество лактозы, то выбирайте сывороточный протеин, который основан на концентрате.

Постарайтесь найти порошковый концентрат сывороточного протеина, содержащий некоторое количество гидролизатов. Гидролизаты действительно гораздо дороже концентратов, однако они действительно стоят этих денег. Гидролизаты не только увеличивают доступность аминокислот и инсулина для мышц (и таким образом максимально стимулируют синтез мышечного протеина и препятствуют его разрушению), но и улучшают растворимость порошка, избавляя вас от комков в шейкере. Практично и эффективно! Кроме того, вы получаете продукт с низким содержанием углеводов и сахара.

Теперь вы знаете все, что необходимо знать о продуктах сывороточного протеина.

Срок годности протеина — Упаковка для спортивного питания

Протеин – это обычный белок, что содержится в большинстве продуктов. Это необходимое вещество для строения мышц и, в целом, поддержания здоровья организма. В основном, его употребляют спортсмены и люди, следящие за фигурой, для поддержания мышц в форме. В данной статье мы ответим на самые интересующие покупателей вопросы: какой срок годности у протеина, как правильно хранить такие коктейли, чтобы получить от них максимальную пользу, и многие другие.

Сроки и правила хранения закрытого протеина

Протеиновые коктейли – это порошки, состоящие из натурального белка с примесями природных компонентов.

Как узнать срок годности протеина? Все просто. Если в составе нет специальных добавок, натуральный продукт хранится от 6 месяцев до 3 лет в закрытой упаковке. Точный срок можно узнать на упаковке.

Срок годности добавок также определяется условиями хранения. При нарушении рекомендуемых правил товар потеряет полезные свойства быстрее. Правильное хранение способно увеличить время сохранения пользы напитка.

Условия хранения добавок:

  • размещать упаковку нужно в сухом месте, иначе во влажной среде могут появиться бактерии и попасть в порошок, где начнут активно размножаться;
  • рекомендуется избегать нагрева состава, попадания ультрафиолетовых лучей;
  • оптимальная температура среды: 20-25 градусов.

Кроме того, важен еще ряд факторов, определяющих срок годности продукции:

  • качество, состав;
  • способ производства;
  • исходное сырье;
  • присутствие консервантов.

Большую роль играет страна производителя. Европейские БАДы сохраняют пользу до 2 лет. Товары, произведенные в Америке – до 3.

Срок годности протеина после вскрытия упаковки

В среднем, время, отведенное для потребления пищевых добавок, составляет максимум три недели. Но опыт людей, применяющих данный продукт, говорит о том, что польза сохраняется в течение 12 месяцев. Данное утверждение не является аксиомой, поэтому лучше не рисковать и обзавестись свежей пачкой.

При хранении открытой емкости необходимо плотно закрывать банку. Проверяйте плотность прижатия крышки, чтобы в порошке не завелись вредоносные микроорганизмы.

Сколько хранится разведенная смесь

Сколько можно хранить разведенный протеин? Это довольно популярный вопрос, ведь многие любят заранее приготовить напиток и взять его, допустим, на тренировку. Ответ таков: в течение 2-3 часов смесь будет сохранять полезные свойства. По истечение 5-6 часов, коктейль считается непригодным. Этого времени достаточно для потери пользы и разрушения белка.

Как понять, что протеин испортился?

Понять, что продукт испортился проще всего опытным путем. Сделать это «на глаз» практически невозможно. В первую очередь, важно помнить, в каких условиях вы хранили банку. Если прилегание крышки было неплотным, а среда влажной, то вероятность, что продукт пропал, возрастает.

Чтобы точно понять, свежий ли продукт, нужно развести порошок, понюхать, попробовать его. Если состав испортился, вы это сразу почувствуете. Аромат просроченного спортивного питания будет неприятным, а вкус заметно отличаться от прежнего. Кроме того, вы заметите изменения консистенции, а порой даже цвета. Состав даже может покрыться плесенью. Это знак, что от упаковки следует немедленно избавиться.

Признаки испорченного спортивного питания:

  • цвет становится прозрачнее;
  • меняется структура;
  • появляется гнилой запах;
  • возможно образование плесени.

Что будет, если выпить просроченный?

Можно ли пить просроченный протеин? Нельзя сказать, что это запрещено, но смысла в этом нет, результата не будет. Испорченный продукт не принесет пользы. Если вы употребили продукт с истекшим сроком годности, вероятность отравления мала. При этом, производитель не может гарантировать эффективность товара и его усвояемость.

При употреблении в пищу БАДов с признаками заражения бактериями, необходимо срочно посетить врача, так как такие вещества могут быть опасны.

Можно ли хранить в холодильнике?

Может ли готовый протеин испортиться в холодильнике? Бытует мнение, что если хранить готовую коктейли в холодильнике, то удастся сохранить их пользу. Это миф. Охлаждение способно замедлить разрушение белка максимум на час, поэтому в течение все тех же 5-6 часов напиток будет испорчен. Поэтому да, приготовленный протеин испортится в холодильнике практически так же быстро, как и в других условиях.

Обзор систем экспрессии белков | Термо Фишер Сайентифик

Экспрессия белков относится к тому, как белки синтезируются, модифицируются и регулируются в живых организмах. В исследовании белков этот термин может применяться либо к объекту исследования, либо к лабораторным методам, необходимым для производства белков. В этой статье основное внимание уделяется последнему значению экспрессии белка. Однако с практической точки зрения производство рекомбинантного белка зависит от использования клеточного механизма.

Посмотреть и выбрать продукты

Введение в экспрессию белка

Белки синтезируются и регулируются в зависимости от функциональной потребности клетки. Чертежи белков хранятся в ДНК и расшифровываются строго регулируемыми процессами транскрипции с образованием матричной РНК (мРНК). Сообщение, закодированное мРНК, затем транслируется в белок. Транскрипция — это перенос информации с ДНК на мРНК, а трансляция — это синтез белка на основе последовательности, заданной мРНК.

Простая схема транскрипции и трансляции. Здесь описывается общий поток информации от последовательности пары оснований ДНК (гена) к последовательности аминокислотного полипептида (белка).


У прокариот процессы транскрипции и трансляции происходят одновременно. Трансляция мРНК начинается еще до полного синтеза зрелого транскрипта мРНК. Эта одновременная транскрипция и трансляция гена называется сопряженной транскрипцией и трансляцией.У эукариот процессы пространственно разделены и происходят последовательно, при этом транскрипция происходит в ядре, а трансляция или синтез белка происходит в цитоплазме.

Сравнение транскрипции и трансляции у прокариот и эукариот.

Справочник по экспрессии белка

Это 118-страничное руководство содержит исчерпывающую информацию об экспрессии белков и поможет вам выбрать правильную систему экспрессии и технологии очистки для вашего конкретного применения и потребностей.Получите советы и рекомендации при начале эксперимента и найдите ответы на повседневные проблемы, связанные с экспрессией белка.

Справочник по экспрессии белков ›


Транскрипция и перевод

Транскрипция происходит в три этапа как у прокариот, так и у эукариот: инициация, элонгация и терминация. Транскрипция начинается, когда двухцепочечная ДНК раскручивается, чтобы обеспечить связывание РНК-полимеразы. После инициации транскрипции РНК-полимераза высвобождается из ДНК.Транскрипция регулируется на различных уровнях активаторами и репрессорами, а также структурой хроматина у эукариот. У прокариот не требуется специальной модификации мРНК, и трансляция сообщения начинается еще до завершения транскрипции. Однако у эукариот мРНК подвергается дальнейшему процессингу с удалением интронов (сплайсинг), добавлением кэпа на 5′-конце и нескольких аденинов на 3′-конце мРНК с образованием полиА-хвоста. Модифицированная мРНК затем экспортируется в цитоплазму, где она транслируется.

Трансляция или синтез белка представляет собой многоэтапный процесс, для которого требуются макромолекулы, такие как рибосомы, транспортные РНК (тРНК), мРНК и белковые факторы, а также небольшие молекулы, такие как аминокислоты, АТФ, ГТФ и другие кофакторы. Для каждого этапа трансляции существуют определенные белковые факторы (см. таблицу ниже). Общий процесс подобен как у прокариот, так и у эукариот, хотя существуют определенные различия.

Во время инициации малая субъединица рибосомы, связанная с инициирующей т-РНК, сканирует мРНК, начиная с 5’-конца, для идентификации и связывания инициирующего кодона (AUG).Большая субъединица рибосомы соединяется с малой субъединицей рибосомы, образуя инициирующий комплекс на инициирующем кодоне. Белковые факторы, а также последовательности мРНК участвуют в распознавании инициирующего кодона и образовании инициирующего комплекса. Во время элонгации тРНК связываются с назначенными им аминокислотами (известно как зарядка тРНК) и перемещают их к рибосоме, где они полимеризуются с образованием пептида. Последовательность аминокислот, добавляемых к растущему пептиду, зависит от последовательности мРНК транскрипта.Наконец, зарождающийся полипептид высвобождается на стадии терминации, когда рибосома достигает кодона терминации. В этот момент рибосома освобождается от мРНК и готова инициировать новый раунд трансляции.


Аппарат для синтеза белка

Краткое изложение основных компонентов и особенностей прокариотического и эукариотического аппарата трансляции.

Компонент

прокариот

эукариот

Рибосомы

30S и 50S субъединицами

40S и 60S субъединицы

Матрица или мРНК

После транскрипции дальнейший процессинг транскрипта мРНК не происходит.

мРНК является полицистронной и содержит несколько сайтов инициации.

После транскрипции транскрипт мРНК подвергается сплайсингу для удаления некодирующих областей (интронов), а кэп-структура (M7-метилгуанозин) и последовательность полиаденозина добавляются на 5′- и 3′-конце сообщения соответственно.

Кэп-структура и поли-А важны для экспорта мРНК в цитоплазму, правильной инициации трансляции и стабильности мРНК среди других функций.мРНК обычно моноцистронная.

Особенности трансляции

Последовательность Шайна-Дальгарно присутствует в транскрипте мРНК, а комплементарная последовательность присутствует в рибосомной субъединице. Это облегчает связывание и выравнивание рибосомы на мРНК в месте инициации трансляции (AUG).

Первой аминокислотой формирующегося полипептида является формилированный метионин.

Инициация трансляции происходит двумя путями:

Кэп-зависимая трансляция: Структура кэпа и белки, связывающие кэп, отвечают за правильное связывание рибосомы с мРНК и распознавание правильного кодона инициации.Первый кодон AUG на 5’-конце мРНК функционирует как кодон инициации. Иногда вокруг инициирующего кодона может присутствовать последовательность Козака.

Cap-независимая трансляция: Связывание рибосомы с мРНК происходит через «внутренний сайт посадки рибосомы» (IRES) на мРНК.

Факторы инициации

Известны три фактора инициации, IF1, IF2 и IF3

Более трех факторов инициации, которые регулируются фосфорилированием.Стадия инициации является лимитирующей стадией эукариотической трансляции.

Коэффициенты удлинения

EF-TU & EF-TS, EF-G

EF1 (α, β, γ) и EF2

TRMINIT

RF1 и RF-2

eRF-1


Посттрансляционная модификация

После трансляции полипептиды модифицируются различными способами для завершения их структуры, определения их местоположения или регулирования их активности внутри клетки.Посттрансляционные модификации (ПТМ) представляют собой различные дополнения или изменения в химической структуре и являются критическими характеристиками общей клеточной биологии.

Типы посттрансляционных модификаций включают:

  • Сворачивание полипептида в глобулярный белок с помощью белков-шаперонов для достижения состояния с наименьшей энергией
  • Модификации присутствующих аминокислот, такие как удаление первого остатка метионина
  • Образование или восстановление дисульфидных мостиков
  • Модификации белков, облегчающие функции связывания:
    • Гликозилирование
    • Пренилирование белков для мембранной локализации
    • Ацетилирование гистонов для модификации взаимодействий ДНК-гистоны
  • Добавление функциональных групп, регулирующих активность белка:
    • Фосфорилирование
    • Нитрозилирование
    • Связывание ГТФ

Методы экспрессии рекомбинантных белков

В целом, протеомные исследования включают изучение любого аспекта белка, такого как структура, функция, модификации, локализация или белковые взаимодействия.Чтобы исследовать, как определенные белки регулируют биологию, исследователям обычно требуются средства производства (производства) интересующих функциональных белков.

Учитывая размер и сложность белков, химический синтез не является приемлемым вариантом для этой цели. Вместо этого живые клетки и их клеточный механизм обычно используются как фабрики для создания и конструирования белков на основе предоставленных генетических шаблонов.

В отличие от белков, ДНК легко сконструировать синтетическим путем или in vitro с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов рекомбинантной ДНК.Таким образом, ДНК-матрицы конкретных генов с добавлением репортерных последовательностей или последовательностей аффинных меток или без них могут быть сконструированы в качестве матриц для экспрессии белков. Белки, полученные из таких матриц ДНК, называются рекомбинантными белками.

Традиционные стратегии экспрессии рекомбинантных белков включают трансфекцию клеток ДНК-вектором, содержащим матрицу, а затем культивирование клеток, чтобы они транскрибировали и транслировали желаемый белок. Обычно клетки затем лизируют для извлечения экспрессированного белка для последующей очистки.Широко используются как прокариотические, так и эукариотические in vivo системы экспрессии белка. Выбор системы зависит от типа белка, требований к функциональной активности и желаемого выхода. Эти системы экспрессии приведены в таблице ниже и включают системы млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий, водорослей и бесклеточные. Каждая система имеет свои преимущества и недостатки, и выбор правильной системы для конкретного применения важен для успешной экспрессии рекомбинантного белка.В следующей таблице представлен обзор систем экспрессии рекомбинантных белков.

Системы экспрессии рекомбинантных белков.


Экспрессия белков млекопитающих

Системы экспрессии млекопитающих могут использоваться для производства белков млекопитающих, которые имеют наиболее нативную структуру и активность благодаря своей физиологически значимой среде. Это приводит к высоким уровням посттрансляционной обработки и функциональной активности. Системы экспрессии млекопитающих являются предпочтительной системой для экспрессии белков млекопитающих и могут использоваться для получения антител, сложных белков и белков для применения в функциональных клеточных анализах.Однако эти преимущества сочетаются с более требовательными условиями выращивания.

Экспрессионные системы млекопитающих можно использовать для временной продукции белков или через стабильные клеточные линии, где экспрессионная конструкция интегрируется в геном хозяина. В то время как стабильные клеточные линии можно использовать в нескольких экспериментах, временное производство может генерировать большое количество белка в течение одной-двух недель. Эти временные, высокопродуктивные системы экспрессии млекопитающих используют суспензионные культуры и могут давать выходы грамм на литр.Кроме того, эти белки имеют больше нативных фолдингов и посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, по сравнению с другими системами экспрессии. В следующем примере для экспрессии рекомбинантных белков использовали 3 различные системы экспрессии млекопитающих.

Выход рекомбинантного белка. Экспрессионные системы Gibco FreeStyle CHO, Expi293 и ExpiCHO использовались для кратковременной экспрессии IgG человека, IgG кролика и ЭПО (эритропоэтина) с использованием pcDNA 3.4 вектор экспрессии. Протокол максимального титра использовали для ExpiCHO, и белки собирали на 10–12 день. Для FreeStyleCHO и Expi293 белки собирали на 6 или 7 день. Все белки определяли количественно с помощью ForteBio Octet или ELISA. Использование ExpiCHO приводит к более высоким титрам белка по сравнению с FreeStyle CHO и Expi293.

Посмотрите это видео о том, как производить рекомбинантные белки с помощью системы экспрессии ExpiCHO.


Экспрессия белков насекомых

Клетки насекомых можно использовать для экспрессии белков высокого уровня с модификациями, подобными системам млекопитающих.Существует несколько систем, которые можно использовать для получения рекомбинантного бакуловируса, который затем можно использовать для экспрессии интересующего белка в клетках насекомых. Эти системы можно легко масштабировать и адаптировать к суспензионной культуре высокой плотности для крупномасштабной экспрессии белка, функционально более похожего на нативный белок млекопитающих. Хотя выход может достигать 500 мг/л, производство рекомбинантного бакуловируса может занимать много времени, а условия культивирования могут быть более сложными, чем в прокариотических системах.

Сводка протокола системы экспрессии бакуловирусов. Бакуловирусная экспрессионная система Invitrogen BaculoDirect использует технологию Invitrogen Gateway для клонирования. После 1-часовой рекомбиназной реакции и трансфекции клеток насекомых образуется бакуловирус, содержащий интересующий ген. Затем можно провести быстрый тест экспрессии, прежде чем амплифицировать вирусный запас и увеличивать экспрессию. Использование этой системы позволяет экспрессировать бакуловирус в клетках насекомых.


Экспрессия бактериального белка

Системы экспрессии бактериального белка популярны, потому что бактерии легко культивируются, быстро растут и дают высокий выход рекомбинантного белка. Однако мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны, потому что клетки не приспособлены для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярной укладки. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые очень трудно восстановить без агрессивных денатурантов и последующих громоздких процедур рефолдинга белков.В следующем примере система на основе бактериальных клеток использовалась для экспрессии 8 различных рекомбинантных белков.

Экспрессия белков в бактериальных клетках. Клонирование Gateway использовали для клонирования 8 белков человека в вектор pET300/NT-DEST Invitrogen Champion. BL21(DE3) E. coli использовали для экспрессии положительных клонов либо в LB + IPTG (1), либо в готовой к использованию среде Invitrogen MagicMedia (2), либо в среде MagicMedia, приготовленной из порошка (3). Образцы лизировали и анализировали на окрашенном кумасси синим белковом геле Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gel.M = стандарт белка Invitrogen SeeBlue. Использование среды MagicMedia E. coli приводит к более высокому выходу белка в различных образцах.


Экспрессия бесклеточного белка

Бесклеточная экспрессия белка – это in vitro синтез белка с использованием совместимых с трансляцией экстрактов целых клеток. В принципе, экстракты цельных клеток содержат все макромолекулы и компоненты, необходимые для транскрипции, трансляции и даже посттрансляционной модификации.Эти компоненты включают РНК-полимеразу, регуляторные белковые факторы, факторы транскрипции, рибосомы и тРНК. При добавлении кофакторов, нуклеотидов и специальной генной матрицы эти экстракты могут синтезировать интересующие белки за несколько часов.

Хотя бесклеточные или системы экспрессии белков in vitro (IVT) не пригодны для крупномасштабного производства, они имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными системами in vivo . Бесклеточная экспрессия позволяет быстро синтезировать рекомбинантные белки без проблем с культурой клеток.Бесклеточные системы позволяют маркировать белки модифицированными аминокислотами, а также экспрессировать белки, которые подвергаются быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. Кроме того, с помощью бесклеточного метода проще одновременно экспрессировать множество различных белков (например, тестирование белковых мутаций путем экспрессии в небольшом масштабе из множества различных матриц рекомбинантной ДНК). В этом репрезентативном эксперименте для экспрессии белка каспазы 3 человека использовали систему IVT.

Экспрессия каспазы-3 в системе IVT человека.Каспазу-3 экспрессировали с использованием набора Thermo Scientific 1-Step Human High-Yield IVT Kit (Human IVT) и в E. coli (рекомбинантный). Активную активность каспазы-3 анализировали с использованием равных количеств белка. Белок каспаза-3, экспрессируемый с помощью системы IVT, был более активен по сравнению с белком, экспрессируемым в бактериях.


Химический синтез белка

Химический синтез белков может использоваться для приложений, требующих белков, меченных не встречающимися в природе аминокислотами, белков, меченных в определенных местах, или белков, токсичных для биологических систем экспрессии.Химический синтез дает очень чистый белок, но хорошо работает только с небольшими белками и пептидами. Выход часто довольно низок при химическом синтезе, а этот метод чрезмерно дорог для более длинных полипептидов.


  1. Иматака Х., Миками С. (2009) Преимущества систем бесклеточного синтеза белка, полученных из клеток человека. Сейкагаку 81 (4): 303–7.
  2. Миками С. и др. (2008) Полученная из клеток человека система транскрипции/трансляции in vitro , оптимизированная для производства рекомбинантных белков. Protein Expr Purif 62(2):190–8.
  3. Кобаяши Т и др. (2007)Улучшенная бесклеточная система для синтеза пикорнавируса. J Virol Methods 142(1-2):182–8.
  4. Миками С. и др. (2006) Система трансляции in vitro на основе гибридомы, которая эффективно синтезирует гликопротеины. J Biotechnol 127(1):65–78.
  5. Миками С. и др. (2006)Эффективная бесклеточная система трансляции млекопитающих, дополненная факторами трансляции. Protein Expr Purif 46(2):348–57.

Производство белка в Escherichia coli определяется компромиссом между доступностью внутриклеточного субстрата и стоимостью энергии | Фабрики микробных клеток

Обзор параметров и переменных приведен в таблице 1.

Таблица 1 Обзор символов, используемых в этом исследовании, и соответствующих им единиц

Диффузионная модель

Сетка

Ради простоты реакционное пространство было дискретизировано в трехмерную решетку с эквидистантным расстоянием между точками сетки.{2} }} \left( {N_{i + 1} — 2 N_{i} + N_{i — 1} } \right).$$

(4)

Основываясь на реакционной схеме на фиг.6, с вероятностями скачка ( г я ) между соседними точками сетки я -. 1 , я, и я + 1 , результирующая реакция может быть получена, как показано в уравнении. 5,

$$\begin{align} \frac{{dN_{i}}}{dt} = d_{1} + d_{4} — d_{2} — d_{3} \hfill \\ {\ text{С}}\;d_{i} = d N_{i} \hfill \\ \end{aligned}$$

(5)

$$\begin{aligned} \frac{{dN_{i} }}{dt} = d \left( {N_{i — 1} — 2 N_{i} + N_{i + 1} } \right) \hfill \\ \widehat{ = }\frac{D}{{\Delta x^{2}}}\left( {N_{i — 1} — 2 N_{i} + N_{i + 1}} \ справа) \hfill \\ \end{align}$$

(6)

Рис.{2} }}$$

(7)

Уравнение 8 вычисляет вероятность того, что молекулы будут прыгать между двумя точками сетки, и его можно использовать для расчета вероятностей прыжков для всех трех измерений.

Случайное блуждание

В основе этой модели лежит случайное блуждание на основе решетки. Рассматриваемые молекулы представляют собой тройные комплексы, состоящие из тРНК, EFTu и рибосом. Транспортом рибосом пренебрегают из-за их гораздо более низкого коэффициента диффузии, а реакционное пространство представляет собой трехмерную решетку с шагом сетки ч .Столкновение между двумя молекулами происходит только в том случае, если они касаются друг друга, что означает, что их расстояние меньше, чем сумма их радиусов. Столкновение на сетке определяется как две молекулы, находящиеся в одной и той же точке. Таким образом, \(N_{a}\) было выбрано равным сумме радиусов тройных комплексов и рибосом. Вероятность ( α i ) перемещения из точки в одну из шести соседних точек определяется как

$$\alpha_{travel,i} = \frac{D}{{h^{2 } }} N_{i}$$

(8)

, где D i — коэффициент диффузии молекулы i , а N i — количество молекул в этом положении ( i 90).{{N_{молекул} }} \mathop \sum \nolimits \alpha_{путешествие,i}$$

(9)

и \(N_{молекул}\) — количество различных возможных тройных комплексов. Приращение времени рассчитывается, как показано в уравнении. 10:

$$\tau = \frac{1}{{\alpha_{0} }}\ln \left( {\frac{1}{{r_{1} }}} \right)$$

(10)

Кроме того, тип путешествующей молекулы j выбран как наименьшее целое число, удовлетворяющее уравнению.{j} \alpha_{i} > r_{2} \alpha_{0}$$

(11)

, где r 1 и r 2 — случайные числа из равномерного распределения между нулем и единицей, рассчитанные с помощью вихря Мерсенна [13, 19]. После каждого шага глобальное время ( t ) увеличивается на τ . Следующим необходимым индексом является молекулярный индекс k , который описывает блуждающую дискретную молекулу вида j ; оно выбирается как случайное целое число от 1 до N j ( N j — это количество молекул вида j ).

Выбранная молекула N j ( k ) затем перемещается к одной из соседних точек сетки, и направление следует случайному распределению между 1 и 6. Каждое движение сопровождается проверкой, где новая позиция N новая сканируется на наличие возможных партнеров по реакции (в данном случае рибосомы с соответствующим антикодоном). Если партнера по реакции нет, алгоритм переходит к следующему шагу. Если есть возможный партнер по реакции, идентифицируется последовательность обновления молекулы, где тройной комплекс расщепляется, а свободный EFTu мгновенно связывается с одной из свободных тРНК, образуя новый тройной комплекс, который случайным образом перемещается в пространстве реакции.Рибосома удлиняет один кодон и не может реагировать в течение промежутка времени t cat , что коррелирует со временем, необходимым для рефолдинга рибосомы и удлинения пептидной последовательности. Он рассчитывается как величина, обратная максимальной удельной скорости элонгации (24 аминокислоты на рибосому в секунду по Арнольду и др. [1]). Во время этого простоя рибосома не может реагировать дальше.

Дополнительным явлением, включенным в эту модель, является диссоциация тройных комплексов.{{N_{молекул} }} \mathop \sum \nolimits \alpha_{diss,i}$$

(13)

Если индекс j в формуле. 11 выбран как более высокий, чем вероятность путешествия, вместо путешествия происходит диссоциация. После диссоциации выбирают вид j и молекулу N j ( k ). Затем эта молекула расщепляется, и лежащая в ее основе тРНК добавляется к пулу свободной тРНК. Высвобожденный EFTu связывает случайно выбранную свободную тРНК и перемещается в случайную точку сетки.

Начальное распределение молекул задается случайным образом для тройных комплексов и рибосом, а начальные состояния рибосом равномерно распределяются по всей последовательности. Трансляция, терминация и инициация в этой модели были исключены, а рибосомы, достигающие конца последовательности, были установлены на первый кодон. Кроме того, весь расчет вложен в цикл с критерием остановки, установленным на 5000 успешных шагов удлинения. Удельную скорость удлинения рассчитывают как наклон номера шага в соответствующие моменты времени.Результирующий наклон (удлинения в секунду или количество аминокислот в секунду) нормализуется по количеству рибосом, в результате чего получается удельная скорость удлинения (удлинения/аминокислоты в секунду на рибосому). Соответствующая ошибка основана на отклонении между десятью различными запусками моделирования с различными начальными значениями для генератора случайных чисел.

Исходные условия

Количество активно транслирующих рибосом (рибосом во время элонгации) и EFTu показаны в таблице 2, а количество тРНК для разных видов показано в таблице 3.{3}\)

Затраты на синтез нуклеотидов

Затраты на нуклеотиды, необходимые для синтеза РНК, описаны в Таблице 4. Стоимость аминокислот была взята из Kaleta et al. [11], где стоимость прекурсоров была исключена. Анализ последовательности и стоимости каждой аминокислоты EFTu привел к затратам на производство 1989 эквивалентов АТФ для синтеза аминокислот и 1576 эквивалентов АТФ для трансляции (4 эквивалента АТФ на этап). Таким образом, общая стоимость синтеза EFTu составила 3565 эквивалентов АТФ на молекулу.Рибосомы состоят из трех типов РНК (5S, 16S и 23S) длиной 120, 1542 и 2906 нуклеотидов соответственно. Эти виды и их соответствующие последовательности приводят к затратам в 42 934 эквивалента АТФ для синтеза рРНК рибосомы. Белковое содержимое рибосом состоит из 7459 АК со средним распределением аминокислот по Шпару [22], что приводит к затратам 35 689 эквивалентов АТФ на синтез аминокислот и 29 836 эквивалентов АТФ на трансляцию. Таким образом, для синтеза рибосом требуется 108 461 эквивалент АТФ на одну молекулу.тРНК в среднем имеют длину 76 нуклеотидов, а средняя последовательность стоит примерно 700 АТФ-эквивалентов на тРНК.

Таблица 4 Затраты энергии на производство пяти различных нуклеотидов на основе стехиометрических путей E. coli

Производство белка Clinisciences

Рекомбинантные белки широко используются в качестве инструментов для исследований в области биологии . Их производство требует определенного опыта, даже если разработка достаточно проста и на рынке существует множество инструментов.

Производство белка – это биотехнологический процесс получения определенного белка . Обычно его получают, манипулируя экспрессией гена в организме таким образом, что он экспрессирует большое количество рекомбинантного гена. Это включает транскрипцию рекомбинантной ДНК в информационную РНК (мРНК), трансляцию мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в функциональные белки и могут быть нацелены на определенные субклеточные или внеклеточные места. Следующим шагом является очистка экспрессированного белка.

Сложность производства белка зависит от сложности оценки и принятия стратегических решений. Необходимо задать следующие вопросы:

  • Должен ли белок экспрессироваться в виде бактерий, дрожжей, клеток насекомых или клеток человека?
  • Какой вектор экспрессии следует использовать?
  • Если сохраняется бактериальная продукция, какие красители следует использовать?
  • Вы хотите сцедить целый белок или часть белка?
  • Следует ли маркировать белок и какой маркер наиболее подходит?
  • Какова правильная стратегия очистки?

Поскольку все белки разные, на эти вопросы нет правильного ответа. Стратегии, выбранные для различных стадий производства белка, будут зависеть от различных факторов, таких как сам белок и использование этого белка в дальнейшем.

Колбы Ultra Yield и улучшенные уплотнения AirOTop
Экономия места — больше объема

Высокопроизводительное производство и кристаллизация белка

Регистрация включает:

  • Размещение
  • Питание, кроме воскресенья, 11 июля.

Регистрационные сборы не включают транспортные расходы.

Платеж

Мы предоставим номер банковского счета.

Критерии выбора

Кандидаты будут выбраны для обеспечения разнообразия пола и географического представительства, и максимум 2 промышленных участника.

Участниками курса будут в основном аспиранты и постдоки. Также может быть выбрана пара опытных сотрудников, выполняющих функции управляющего основным объектом.

Основным критерием будет мотивация участников к успешному внедрению высокопроизводительных методов в свою текущую исследовательскую деятельность. Это означает либо работу с большим количеством белков или вариантов, либо работу с белковыми комплексами.

Обязательны предварительные знания в области клонирования, экспрессии белков и кристаллизации.

Абстрактные руководства

Тезисы должны содержать название, авторов и принадлежность авторов к организациям, а также содержать не более 300 слов.

В дополнение к реферату соискатели должны предоставить мотивационное письмо, резюме и одно рекомендательное письмо.

Характеристики плаката

Портативный формат, 84,1 см x 118,9 см

Пособие на проезд

Участникам доступно ограниченное количество грантов на поездки. Кандидатам не нужно отдельно подавать заявку на грант на поездку для этого мероприятия, но они должны указать в регистрационной форме, хотят ли они быть рассмотренными для получения гранта на поездку. Выбор лауреатов осуществляется непосредственно организатором, который уведомляет всех правомочных участников.Более подробная информация доступна на странице EMBO Travel Grants.

Для участников любой национальности, работающих в лабораториях Чили, Индии, Сингапура и Тайваня, предоставляются специальные гранты на поездки и освобождение от оплаты. Чтобы подать заявку, отправьте электронное письмо непосредственно организаторам встречи с обоснованием вашего запроса.

Пособие по уходу за ребенком

Курсы и семинары EMBO предлагают гранты для компенсации дополнительных расходов на уход за детьми, понесенных участниками или докладчиками при участии в любом собрании, финансируемом курсами и семинарами EMBO.Приемлемые расходы включают плату за услуги опекуна или детского учреждения, дорожные расходы опекуна или транспортные расходы, связанные с доставкой ребенка на собрание и т. д. Пожалуйста, укажите в регистрационной форме, хотите ли вы, чтобы вы рассматривали возможность получения гранта. Пожалуйста, также опишите, как вы собираетесь использовать пособие по уходу за ребенком, и укажите сумму, которая вам потребуется.

Сравнительная оценка производства рекомбинантных белков на различных биофабриках: Зеленая перспектива

В последние годы производство рекомбинантных фармацевтических белков в гетерологичных системах значительно возросло.В большинстве приложений используются сложные белки и гликопротеины, которые трудно производить, что способствует развитию и совершенствованию широкого спектра производственных платформ. Ни одна отдельная система не является оптимальной для производства всех рекомбинантных белков, поэтому разнообразие платформ на основе растений дает значительное преимущество. Здесь мы обсуждаем производство четырех рекомбинантных фармацевтических белков с использованием различных платформ, выделяя из этих примеров уникальные преимущества систем на основе растений по сравнению с традиционными платформами экспрессии на основе ферментеров.

1. Введение

Рынок рекомбинантных фармацевтических белков быстро расширяется. Действительно, почти все фармацевтические компании с рыночной капитализацией более 10 млрд долларов США сообщают, что их доля доходов от таких продуктов растет быстрее, чем доля низкомолекулярных препаратов [1]. Промышленность сосредоточилась на небольшом количестве производственных платформ, основанных на бактериях Escherichia coli , нескольких видах дрожжей и ряде клеточных линий насекомых и млекопитающих, которые были разработаны и улучшены в соответствии с действующей надлежащей производственной практикой (cGMP). ).Однако сосредоточение внимания на небольшом количестве платформ означает, что трудно удовлетворить уникальные требования определенных целевых белков; это относится к рекомбинантным белкам, которые требуются в небольших количествах (например, для отдельных пациентов) или в больших количествах, или которые требуют быстрого расширения производства. Биотехнология растений может преодолеть некоторые из этих ограничений, и хорошо задокументирован потенциал растительных платформ для гибкого и недорогого производства высококачественных биоактивных рекомбинантных белков [2].

Растения успешно выполняют большинство посттрансляционных модификаций, необходимых для активности сложных эукариотических белков, и обеспечивают огромную гибкость с точки зрения масштаба, стоимости, безопасности и регуляторных вопросов. Например, клеточные биореакторные системы, включающие в себя растительные суспензии клеток и водоросли, идеально подходят для производства небольших объемов продукции, в то время как товарные культуры, выращенные в поле, могут производить метрические тонны рекомбинантного белка по очень конкурентоспособным ценам. Замкнутые производственные системы, основанные на растениях, имеют преимущества с точки зрения биобезопасности по сравнению с платформами для производства микробов и млекопитающих, поскольку они не производят эндотоксины и не поддерживают рост патогенов, заражающих животных, что снижает затраты на очистку и сводит к минимуму вероятность закрытия объектов, проблем с обеззараживанием и поставками. ограничения, которые приводят к неудовлетворенным требованиям пациентов/клиентов.Несмотря на то, что затраты на последующую обработку и очистку сопоставимы на микробных, млекопитающих и растительных платформах, ключевыми преимуществами являются меньшие первоначальные инвестиции, необходимые для коммерческого производства растений, и потенциальная экономия масштаба, обеспечиваемая выращиванием на больших площадях.

Такое сочетание низких капитальных вложений, низкой стоимости товаров и высоких масштабов производства означает, что многие белки, непригодные для производства в ферментерах, могут производиться в промышленных масштабах с использованием растений.Другие белки могут быть получены более эффективно путем ферментации в растительных клетках, поскольку посттрансляционные модификации могут быть сконструированы для улучшения качества и активности продукта. Не все фармацевтические препараты выиграют от растительных систем, но наилучшая производственная платформа должна определяться эмпирически для каждого белка с использованием индивидуального подхода. В нескольких недавних обзорах обсуждались достоинства фармацевтических препаратов растительного происхождения [3], в том числе конкретные вопросы, связанные с коммерческим производством [4], и вопросы цГМФ в растениях [5].В этом обзоре основное внимание будет уделено четырем молекулам-мишеням, которые освещают различные области применения в различных системах экспрессии, чтобы проиллюстрировать важные пути развития платформ экспрессии на основе растений для удовлетворения широкого спектра потребностей в исследованиях, разработках и коммерческих целях.

2. Декарбоксилаза глутаминовой кислоты человека

Изоформа декарбоксилазы глутаминовой кислоты человека с молекулярной массой 65 кДа (hGAD65) представляет собой фермент, содержащий простетическую группу пиридоксаль-5′-фосфата (PLP). Он образует облигатные функциональные димеры и локализуется в β -островковых клетках поджелудочной железы, а также в головном мозге, где он катализирует превращение глутамата в γ -аминомасляную кислоту (ГАМК) и углекислый газ.В клетках человека основной пул hGAD65 существует в виде аутоинактивированного апофермента [6]. Кристаллическая структура дает представление как о молекулярном механизме каталитической активности, так и о структурных детерминантах его антигенности [6].

Белок hGAD65 действует как аутоантиген при нескольких аутоиммунных заболеваниях, включая аутоиммунный диабет 1 типа (СД1) и синдром Стифф-Персона. T1D тесно связан с аутореактивностью к hGAD65. Действительно, аутоантитела к hGAD65 присутствуют до клинического начала заболевания и являются полезным маркером для прогнозирования вероятности его развития [7].Актуальность таких маркеров была однозначно подтверждена во многих лабораториях, участвующих в Программе стандартизации диабетических аутоантител (DASP), являющейся результатом сотрудничества Центров США по контролю и профилактике заболеваний и Общества иммунологии диабета [8].

Аутоантитела не являются непосредственно патогенными, тогда как Т-клетки играют доминирующую роль в инициации и прогрессировании СД1. Т-клеточные ответы против линейных эпитопов hGAD65 могут быть обнаружены на животных моделях заболевания и у людей с риском развития СД1.Исследования на животных моделях показали, что воздействие hGAD65 может вызывать иммунотолерантность [9, 10]. Клиническое исследование фазы II на людях, включающее генетически предрасположенных детей и молодых людей с множественными аутоантителами к островковым клеткам, в настоящее время изучает, предотвращает ли лечение, включающее две инъекции доз 20  мкг г hGAD65 в форме квасцов (вакцина против GAD, Diamyd Medical). начало заболевания (NCT01122446).

Распространенность СД1 в общей популяции в настоящее время равна 0.04%, но этот показатель увеличивается на 3% в год у детей. Если клинические испытания, описанные выше, будут успешными, то глобальный спрос на рекомбинантный hGAD65 резко возрастет. Первоначально GAD65 получали из свиного мозга, хотя наиболее распространенным источником является мозг обезьяны с выходом 12 мг/г [11]. Эти источники не подходят для терапевтического GAD65 из-за риска заражения прионами и другими патогенами, поэтому после выделения кДНК hGAD65 были исследованы гетерологичные методы получения [12].

Во всех гетерологичных системах о выходе hGAD65 сообщают путем измерения его ферментативной и иммунохимической активности. Посттрансляционные модификации происходят в N-концевой области, то есть блокировка N-концевой аминогруппы, пальмитоилирование и фосфорилирование, но ни одна из этих модификаций не является необходимой для каталитической активности или иммуногенности, поэтому теоретически белок может быть получен с использованием любой экспрессии. платформа [11]. Кроме того, отмена ферментативной активности для создания мутантного белка (hGAD65mut) не влияет на иммунореактивность белка и, следовательно, на его диагностический и терапевтический потенциал [13].

Существующие коммерческие платформы для производства GAD65 диагностического и исследовательского качества включают дрожжи, инфицированные бакуловирусом клетки насекомых и лизаты зародышей пшеницы по цене 2 000–60 000 евро/мг. Обсуждалась пригодность этих различных производственных платформ. Например, экспрессия GAD65 в бактериях продуцировала белок с неправильной укладкой, который был в основном локализован в тельцах включения, и было возможно получить растворимый и иммуногенный продукт только путем экспрессии белка в виде N-концевого слияния с тиоредоксином или глутатион-S-трансферазой. [14, 15].Партнеры по слиянию не только сделали белок растворимым, но и облегчили выделение белка, что привело к выходу до 12,5 г/л.

Рекомбинантный hGAD65 также был экспрессирован в клетках почек детенышей хомячка (BHK) (Heinaes et al., неопубликованные данные), клетках яичника китайского хомячка (CHO) и клетках миеломы мыши, причем последний приводил к максимальному выходу 1,7 мг/мг. Л [16]. Хотя общий выход был ниже, чем у бактерий, рекомбинантный белок был растворим и сохранял свою нативную структуру без партнера по слиянию.Таким образом, клетки CHO использовались для изучения внутриклеточного переноса и локализации hGAD65. [17]. Клетки насекомых, инфицированные бакуловирусными векторами, достигли самых высоких выходов hGAD65 из когда-либо зарегистрированных, в лучших случаях достигая 50 мг/л [18], но когда hGAD65 экспрессировался с С-концевой меткой His 6 , выход снижался до 3–3. 5 мг/л [19].

Несколько растительных платформ также использовались для производства hGAD65. хлоропластов Chlamydomonas reinhardtii трансформировали вектором hGAD65, и иммунореактивный рекомбинантный белок составлял 0,3% от общего растворимого белка (TSP) в клетках водорослей [20]. Иммунореактивный и ферментативно активный hGAD65 также экспрессируется в растениях табака и моркови, хотя и с неутешительными результатами; например, у растений табака Т1 урожайность составила 10,5  мкг/г г/г сырой массы (СМ) в листьях [21–23].

Производство hGAD65 в клеточных платформах растений и насекомых было достигнуто путем экспрессии каталитически неактивной версии hGAD65mut, которая сохраняет свою иммуногенность. Мутантный белок накапливается до более высоких уровней, чем его активный аналог, то есть до 143,6  мк г/г сырой массы в листьях табака [23]. Мутант hGAD65mut был получен путем замены остатка лизина, который связывает кофактор PLP, остатком аргинина (K396R). Было высказано предположение, что версия hGAD65 дикого типа вмешивается в метаболизм растительных клеток, подавляя собственный синтез, тогда как каталитически неактивная версия избегает такой обратной связи и накапливается до более высоких уровней.

Были экспрессированы и другие модифицированные версии GAD65, включая растворимую форму, полученную путем замены N-концевого домена гомологичной областью растворимой изоформы белка массой 67 кДа. Эта замена увеличивала выход белка с 3,52 до 12,16 мг/л в S. cerevisiae [17] и с 10,5 до 50  мкг/г в листьях табака [24]. Хотя различия в стабильности N-концевых α -спиральных областей теоретически могут объяснить эти различия, не было улучшения выхода hGAD65mut в растениях при включении модификации [25].Это говорит о том, что устранение мембранных взаимодействий путем удаления N-концевой области не дает каких-либо дополнительных преимуществ при устранении биологической активности белка.

Модификация белка для удержания в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) растительных клеток не привела к увеличению его выхода в трансгенных растениях табака [25]. GAD67/65mut также экспрессировался в семенах трех разных видов (Arabidopsis, табак и петуния) и сохранялся в ER. Самый высокий урожай 4.В семенах арабидопсиса было достигнуто 5 мг/г сухой массы (СВ) [26].

Очистку hGAD65 из клеток дрожжей, насекомых и млекопитающих обычно проводят с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием моноклональных антител против GAD [16, 27], анионообменной хроматографии [18] или их комбинации [17]. У бактерий и дрожжей более высокие выходы были достигнуты за счет экспрессии меченых белков слияния и использования метки в качестве аффинного лиганда [15, 19, 28]. Хотя об очистке hGAD65 в растениях не сообщалось, съедобные растительные ткани, содержащие этот белок, можно вводить перорально, так что обширная очистка не требуется.Было продемонстрировано, что пероральное введение неочищенного экстракта трансгенного табака, содержащего hGAD65, в сочетании с интерлейкином-4 (ИЛ-4), уменьшало периферический иммунный ответ на последующую системную стимуляцию тем же аутоантигеном, индуцируя пероральную толерантность [21]. .

3. Вирусоподобные частицы Норуолк

Вирус Норуолк (NV) является прототипом норовируса человека (NoV), который содержит одноцепочечный безоболочечный геном РНК с положительным смыслом, содержащий три открытые рамки считывания и полиаденилатный хвост [29] .Капсид NV представляет собой икосаэдрическую структуру размером 38 нм, собранную из 90 димеров VP1, капсидного белка (CP) с молекулярной массой 58 кДа, с симметрией [30, 31]. NoV относится к группе высокоинфекционных вирусов, ответственных за более чем 95% эпидемических вспышек вирусных гастроэнтеритов у взрослых в развитых и развивающихся странах [32]. Только в США NoV вызывает около 21 миллиона инфекций в год, что приводит к 70 000 госпитализаций и 800 смертей, что обходится в 5,5 миллиардов долларов США [33] (https://www.bcm.edu/molvir).В развивающихся странах NoV является причиной до 1,1 млн госпитализаций ежегодно и 218 000 смертей среди детей [32].

Растущее признание NoV как возбудителя заболевания, отсутствие специфического лечения и ограниченный успех в предотвращении вспышек заболевания привели к оценке вакцин на основе вируса [34]. Однако недостаточное количество вирусных частиц, доступных для анализа, задержало разработку такой вакцины. Единственным естественным источником частиц NV является стул человека, который обычно содержит очень низкие концентрации вирусов [29].

Успешное клонирование, секвенирование и экспрессия основного капсидного белка NV VP1 в клетках насекомых стали крупным прорывом и показали, что рекомбинантный VP1 спонтанно сворачивается в пустые вирусоподобные частицы Norwalk (NVLP), которые стабильны после лиофилизации при температурах до до 55°С и/или при воздействии кислот (pH 3–7) [35]. Рекомбинантные NVLP остаются иммуногенными и взаимодействуют с клеточными рецепторами, вызывая сильный иммунный ответ хозяина против вируса [29, 31, 36, 37], и поэтому могут быть идеальными кандидатами на вакцину от NV [38, 39].

Доклинические исследования показали, что рекомбинантные НВЛП являются иммуногенными при парентеральном [29], пероральном [40, 41] и интраназальном путях введения [42]. Кроме того, специфический состав для интраназальной доставки, включающий сухой порошок NVLP и новый полисахарид растительного происхождения с гелеобразующими свойствами (GelSite), показал более высокую иммуногенность у мышей, чем жидкий состав, включающий адъювант [43].

В исследованиях фазы I перорально вводимые NVLP были признаны безопасными, но лишь умеренно иммуногенными, что определялось путем измерения уровней антител в сыворотке и подсчета клеток, секретирующих специфические антитела (ASC) [44–46].И наоборот, назальная форма NVLP, включающая адъювант, хорошо переносилась и обладала высокой иммуногенностью [47]. Исследование фазы I/II, проведенное LigoCyte Pharmaceuticals, показало, что две интраназальные дозы 50  мкг г NVLP защищают мышей от заражения гомологичным вирусом [48]. Кроме того, парентеральное введение в исследованиях фазы I/II продемонстрировало, что две 100  мкг/ г внутримышечной дозы вакцины NVLP хорошо переносились и оказывали клинически значимое влияние на частоту возникновения NV после контрольного заражения, а также на тяжесть в случаях обострения (Takeda Фармасьютикалс США Инк., 2013). В совокупности эти клинические испытания показали, что вакцинация может быть полезной для предотвращения заболеваний, вызываемых штаммами NoV, которые чаще всего ассоциируются с инфекциями у людей. Если будущие клинические испытания подтвердят эффективность вакцины NVLP на людях, потребуется большое количество NVLP для проведения глобальных кампаний вакцинации.

Разработке эффективной вакцины против НВ препятствовало отсутствие животной модели продукции вируса и невозможность выращивания всего вируса в клеточной культуре.Поэтому было протестировано несколько систем экспрессии для продукции NVLP, включая инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих и растительные системы. Эти производственные платформы были исследованы с помощью электронной микроскопии, чтобы подтвердить тот факт, что белок оболочки вируса Норуолк (NVCP) самособирается в NVLP. Кроме того, иммуногенность рекомбинантных NVLP была исследована на животных.

Первая попытка получения NVCP в гетерологичной системе включала инфицированные бакуловирусом клетки насекомых ( Spodoptera frugiperda ) (Sf9).Были обнаружены NVLP, сходные по размеру и внешнему виду с нативными капсидами, и хотя данных об экспрессии не сообщалось, выход очищенного белка составлял от 65 до 125  мг на литр инфицированных культур клеток насекомых [29].

NVCP, представляющие различные штаммы NV, также экспрессировались в E. coli в виде слитых белков с мальтозо-связывающим белком (MBP) и тиоредоксином. Выходы очищенных слитых белков составили 26 и 56 мг/л соответственно, но NVLP не были обнаружены.Несобранные очищенные капсидные белки были проанализированы для определения возможности создания иммунологической системы обнаружения антигенов NoV на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и подтверждения диагноза NoV-инфицированных пациентов с использованием рекомбинантного NVCP [49].

NVCP был успешно экспрессирован в системе P. pastoris после тестирования ряда векторов экспрессии и условий культивирования. Рекомбинантный NVCP спонтанно образовывал NVLP с конечным выходом 5–10 мг/л после очистки.Полученные из дрожжей NVLP были протестированы в качестве потенциальных пероральных вакцин против NV путем скармливания животным экстрактов сырых дрожжей. Даже в таких низких дозах, как 0,1 мг, NVLP, полученные из дрожжей, были способны вызывать значительные системные реакции и реакции слизистой оболочки кишечника у животных [50].

Репликонные частицы вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) (VRP) использовались в качестве векторов для экспрессии NVCP в клетках BHK, что приводило к получению NVLP с выходом приблизительно 10 10 частично очищенных частиц на мл [51].VRP можно использовать как в качестве векторов для создания NVLP в гетерологичных системах, так и в качестве самореплицирующейся вакцины, которая продуцирует рекомбинантные NVLP в клетках-мишенях. У мышей, инокулированных подкожно этими частицами (две дозы по 10 7 инфекционных единиц каждая), развивался системный и слизистый иммунный ответ на НВПЧ, а также гетеротипический гуморальный ответ на главный капсидный белок из другого штамма НВ [52].

NVLP также были получены во многих растительных системах, при этом первоначальные эксперименты были сосредоточены на конститутивной экспрессии в трансгенных растениях.Рекомбинантные NVCP самособирались в NVLP, которые составляли 0,23% TSP в листьях трансгенного табака [41], и NVCP также накапливали до 0,37% TSP в клубнях трансгенного картофеля (34  μ г/г массы клубня), хотя и только ~50 % самостоятельно собранных в NVLP. Пероральная иммуногенность частично очищенных NVLP из табака и картофеля была продемонстрирована на мышах [41], тогда как клинические исследования фазы I на людях показали, что введение сырого картофеля, содержащего NVLP, было безопасным, но лишь умеренно иммуногенным [45].

Модифицированный ген NVCP, кодон-оптимизированный для растений, позже был экспрессирован в томате и картофеле, что привело к накоплению NVCP на уровне до 8% TSP в плодах томата и 0,4% TSP в клубнях картофеля, что соответствует 160  μ г/г (100  μ г ПНВП/г) в плодах томата и 120  μ г/г (90  μ г ПНВП/г) в клубнях картофеля. Лиофилизированные ткани картофеля и помидоров были иммуногенными при скармливании мышам, но доставка таких же доз высушенных на воздухе плодов помидоров стимулировала более сильный иммунный ответ.Было высказано предположение, что сушка на воздухе сохраняет стабильность NVLP и структуру ткани плода, тем самым обеспечивая большую защиту от протеолитических ферментов в кишечнике [53].

Совсем недавно векторы MagnICON использовались для быстрого и эффективного производства NVLP в растениях Nicotiana benthamiana . Были сопоставлены различные субклеточные локализации, и самые высокие выходы были достигнуты при нацеливании на цитозоль (860  мк г NVCP/г сырой массы в листьях) через 12 дней после заражения (dpi).Частично очищенные рекомбинантные NVLP были перорально иммуногенными при скармливании беспородным мышам CD1 [54].

Агроинфильтрация листьев N. benthamiana оптимизированным репликоном ДНК из вируса желтой карликовости фасоли привела к эффективной амплификации репликона и надежному производству NVCP в течение 5 дней. Выход NVCP составлял ~340  мкг г/г сырой массы в листьях, и белок эффективно собирался в NVLP [55]. Тот же вектор экспрессии был недавно использован в салате, который продуцирует низкие уровни вторичных метаболитов.Это привело к среднему выходу NVCP 200  μ г/г сырой массы в листьях [56]. Производство NVLP в растениях N. benthamiana также было оптимизировано с использованием опосредованной Agrobacterium переходной экспрессии генов для одновременной экспрессии двух капсидных белков NV (VP1 и VP2) для повышения стабильности NVLP, наряду с легкой крапчатостью перца . вирус , супрессор вирусного посттранскрипционного молчания генов. Это позволило достичь выхода до 1  мг частично очищенных NVLP на 1 г сырой массы листьев [57].

Очистка NVLP обычно достигается с использованием методов ультрацентрифугирования и градиента плотности, которые используют размер и плотность частиц независимо от платформы экспрессии [29, 41, 46, 51, 54, 55, 57]. Однако эти методы технически сложны и их трудно масштабировать, поэтому были изучены альтернативные стратегии обработки [50, 56, 58]. Осаждение при низком pH в сочетании с анионообменной хроматографией с ДЭАЭ недавно позволило эффективно очистить NVLP от N.benthamiana листьев [59]. Это был первый отчет, описывающий масштабное производство вакцины NVCP фармацевтического класса (совместимой с cGMP) на растениях, и в настоящее время этот продукт проходит фазу I клинических испытаний на людях.

4. Моноклональное антитело 2G12

Моноклональное антитело (мАт) 2G12 представляет собой широко нейтрализующий анти-ВИЧ-1 IgG1 человека, который распознает кластер гликанов с высоким содержанием маннозы на поверхности вирусного гликопротеина 120 (gp120). Он был выделен от бессимптомного ВИЧ-1 инфицированного пациента в 1990 г., а в 1994 г. впервые была описана его нейтрализующая активность в отношении штаммов ВИЧ-1 и способность связываться с gp120 [60, 61].Широкая биологическая активность 2G12 позволяет ему защищаться от инфицирования первичными изолятами ВИЧ из различных кладов либо путем прямой нейтрализации вируса, либо путем комбинации с другими эффекторными клетками и активации комплемента [62].

Наряду с нейтрализацией ВИЧ-1 in vitro исследования пассивного переноса на приматах показали, что 2G12 может контролировать инфекцию и предотвращать передачу in vivo после парентерального введения или введения через слизистые оболочки, предпочтительно в сочетании с другими нейтрализующими антителами [63, 64] .Фаза I исследования на людях продемонстрировала безопасность повторных внутривенных вливаний 2G12 в сочетании с другим антителом широкого нейтрализующего действия (2F5) при введении бессимптомным пациентам, инфицированным ВИЧ-1 [65, 66]. Более того, 2G12 в сочетании с двумя широко нейтрализующими антителами (2F5 и 4E10) был способен отсрочить восстановление вируса у пациентов, у которых инфекции были полностью подавлены антиретровирусной терапией до введения антител [67]. Затем было проведено испытание фазы II для изучения фармакокинетических свойств антител в коктейле [68].Такие подходы требуют больших доз рекомбинантных антител (7–14 мкг каждого антитела на пациента) и, таким образом, создают огромный спрос, учитывая, что в 2012 году около 35 миллионов человек жили с ВИЧ (ЮНЭЙДС, 2013).

Человеческие моноклональные антитела широкого спектра действия, такие как 2G12, также можно применять в качестве микробицида слизистых оболочек для профилактики ВИЧ-инфекции [69]. Рекомбинантная форма 2G12, продуцируемая в стабильных трансформированных растениях табака, была протестирована в фазе I клинических испытаний, основанных на интравагинальном введении антитела здоровым женщинам в диапазоне доз 7–28 мг на человека (NCT01403792).В будущих испытаниях будет проверена эффективность профилактики у людей [70].

Сложная и гликозилированная структура 2G12 означает, что он должен быть получен на эукариотических платформах экспрессии, а затем протестирован в специальных анализах для подтверждения его in vitro антигенсвязывающей и нейтрализующей способности. Молекула первоначально была получена в гибридомных клонах, полученных путем электрослияния В-клеток и клеток миеломы CB-F7, производящих 10 мкг антитела на клетку в день [60]. мРНК тяжелой и легкой цепей 2G12 была выделена и транскрибирована в кДНК в 1998 г. [71].Затем в клетках СНО достигали крупномасштабной продукции антител, и антитело очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А. Для большинства исследований in vivo и клинических испытаний 2G12 IgG1 производился компанией Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH (Вена, Австрия) в соответствии с рекомендациями cGMP по цене 350–500 евро/мг. Уникально то, что 2G12, подготовленный для клинических испытаний NCT01403792, был изготовлен из листьев табака с использованием нового процесса cGMP.

Антибиотики против ВИЧ должны быть эффективными, безопасными, удобными для использования и, прежде всего, экономически доступными в развивающихся странах, где проживает наибольшее число пациентов с ВИЧ.Растения идеально подходят для производства таких антител с низкой маржой и высоким спросом из-за экономии за счет масштаба, предлагаемой сельскохозяйственным производством. Эта концепция была разработана в рамках проекта ЕС Pharma-Planta, в рамках которого удалось добиться экспрессии 2G12 в нескольких видах растений и ускоренной разработки трансгенного табака в качестве основной производственной платформы. Использование многих различных растений показало, что вид, ткань и субклеточный компартмент могут влиять на структуру и состав гликанов антител, но это не оказало существенного влияния на способность антитела in vitro нейтрализовать ВИЧ [72].

Секретируемая форма 2G12 была конститутивно экспрессирована в листьях растений арабидопсиса дикого типа [73] и в мутантном штамме, модифицированном для нокаута генов, кодирующих β 1,2-ксилозилтрансферазу (XT) и ядро ​​ α 1,3-фукозилтрансферазу (FT), таким образом продуцируя сложные N-гликаны, в которых отсутствуют специфичные для растений остатки [74]. Выход антител составил 0,05–0,2% от ОЧП в этих молодых растениях. Секретируемые и сохраняемые в ЭР версии 2G12 также были получены в семенах арабидопсиса с выходом 3.6 и 2,1 мг/г сухой массы соответственно [75]. В той же серии экспериментов секретируемая форма 2G12 также продуцировалась в семенах нокаутной линии XT/FT [75].

Злаки считаются более подходящими для производства рекомбинантных белков в развивающихся странах, поскольку сухие семена сохраняют рекомбинантные белки в стабильной форме без холодовой цепи, и в этом контексте кукуруза широко используется для производства фармацевтических белков. Секретируемая форма 2G12 экспрессировалась в эндосперме элитного сорта кукурузы M37W, а наиболее эффективная линия была подвергнута циклу дедифференцировки-регенерации, в результате чего были получены семена, дающие более 100  мкг г антител на грамм сухой массы и устраняющие большая часть вариации от семени к семени [76].Анализы нейтрализации ВИЧ показали, что 2G12, полученный из кукурузы, был почти в три раза более активным, чем его аналог, полученный из CHO, что, вероятно, отражает более высокую долю агрегатов (которые, как известно, более эффективны, чем мономерные антитела с точки зрения эффективности нейтрализации). То же самое антитело также сохраняется в ER клеток эндосперма кукурузы путем добавления С-концевой метки KDEL к обеим цепям антител, что приводит к его накоплению в зеиновых белковых телах, происходящих из ER [70]. Эти эксперименты проводились с использованием сорта Hill, но, поскольку этот сорт не имеет большого агрономического значения, он был подвергнут обратному скрещиванию с элитной зародышевой плазмой крахмала и сахарным фоном сладкой кукурузы.Средний выход в поколении Т3 составил 38,8  μ г/г сухой массы, с максимальным выходом 60  μ г/г сухой массы. Как указано выше, антитело растительного происхождения было более эффективным в анализах нейтрализации, чем такое же антитело, продуцируемое в клетках СНО.

Антитело 2G12 также было получено путем кратковременной экспрессии в листьях N. benthamiana , первоначально с использованием трех гликоинженерных линий, в которых РНК-интерференция (РНКи) использовалась для подавления синтеза ксилозилированного и/или сердцевинного α 1,3 -фукозилированные гликановые структуры [77].Бинарный вектор, несущий последовательности кДНК обеих цепей антитела, использовали для агроинфильтрации, и выход составил 110  мк г/г сырой массы (соответствует примерно 0,5% TSP) в листьях. Аналогично, листьев N. benthamiana коинфильтрировали двумя бинарными векторами, один из которых кодировал две цепи антител, а другой нес ген-супрессор сайленсинга p19 [78]. Секретируемые и удерживаемые в ЭР формы антитела продуцировались с выходом ~100  мк г/г сырой массы в листьях при 6 dpi, увеличиваясь до 18 dpi.Наблюдалось небольшое снижение антигенсвязывающей активности по сравнению с 2G12 из клеток СНО, вероятно, отражающее присутствие остаточных примесей, но, как указано выше, способность к нейтрализации ВИЧ была выше. Антитело 2G12 также временно экспрессировалось в листьях N. benthamiana с использованием реплицирующихся и нереплицирующихся систем, основанных на делетированных версиях РНК-2 вируса мозаики вигны (CPMV) [79]. В обоих случаях экспрессировались секретируемые и сохраняемые в ER версии антитела, что давало 14.8; Полученное антитело снова показало немного более низкую аффинность к своему антигену, но аналогичную или чуть лучшую нейтрализующую активность по сравнению с 2G12, продуцируемым в клетках CHO.

Табак использовался как для временной, так и для стабильной экспрессии 2G12. Секретируемые и ER-сохраненные формы временно экспрессировались в листьях табака, коинфильтрированных векторами Agrobacterium tumefaciens , содержащими экспрессионные конструкции для тяжелых и легких цепей, с достижением выхода 80–100  мк г/г сырой массы в листьях [78].ER-сохраненная форма стабильно экспрессировалась в листьях трансгенного табака, составляя 0,4% TSP в зрелых листьях [80]. Как и выше, последующие анализы показали, что антитело растительного происхождения слабее связывало свой антиген, но нейтрализовало ВИЧ более эффективно, чем аналог, полученный из CHO. Экспрессия 2G12 в семенах табака достигла выхода 0,3% TSP, а исследования иммунолокализации показали, что антитело накапливается в вакуолях для хранения белка (PSV). Антитело, полученное из семян, показало значительно более низкую антигенсвязывающую активность, чем белок, полученный из листьев, что, вероятно, отражает генетическую сегрегацию и, таким образом, образование значительной части семян, экспрессирующих только тяжелую цепь.

Наконец, 2G12 также экспрессировался в культурах суспензий клеток табака, приготовленных из сорта BY-2 [81]. Оптимизация подачи азота повысила выход до 12 мг/л к 7-му дню процесса ферментации. Антитело секретировалось в среду, но его часть также накапливалась внутри клеток. Антигенсвязывающая активность полностью секретированного антитела составила 83 % по сравнению с аналогом CHO (условно установленным за 100 %), тогда как активность внутриклеточной фракции составила 40 %. Вероятно, это отражает тот факт, что внутриклеточное антитело представляет собой гетерогенную смесь, содержащую все формы антитела на разных стадиях созревания, укладки и сборки, тогда как в среду секретируется только полностью уложенная и собранная версия.

Было предложено несколько стратегий для повышения выхода и стабильности рекомбинантных белков растительного происхождения и снижения затрат на обработку [2]. Например, использование эластиноподобных полипептидов (ELP) в качестве партнеров по слиянию может повысить растворимость и стабильность рекомбинантных белков и облегчить очистку с помощью процесса, называемого обратным переходным циклом (ITC) [82]. Различные версии 2G12 конститутивно экспрессировались в листьях и семенах трансгенного табака путем слияния одной или обеих цепей антител с ELP, увеличивая выход до 1% TSP [80].Последующая характеристика очищенных антител показала, что слияние ELP не мешает сборке антител в табаке и придает рекомбинантным антителам большую антигенсвязывающую активность, хотя и за счет эффективности нейтрализации ВИЧ. В отсутствие подходящего партнера для слияния очистка антител, таких как 2G12, обычно включает аффинную хроматографию с белком А, дорогостоящий вариант обработки, который обеспечивает выход 50–85% в зависимости от платформы, но является дорогостоящим вариантом обработки.Поэтому на основе традиционных методов хроматографии были разработаны дополнительные протоколы, не связанные с белком А, которые могут обеспечить степень извлечения 50–60% и чистоту до 90% (например, [76, 83]).

5. Интерлейкин-6 человека

Интерлейкин-6 человека (hIL-6) представляет собой секретируемый гликопротеин с молекулярной массой 26 кДа из семейства многофункциональных цитокинов, который выполняет разнообразные физиологические функции, включая индукцию острофазового ответа и воспаления, регуляцию иммунного ответа и стимулирование дифференцировки В-клеток в клетки, секретирующие иммуноглобулин [84].Белок hIL6 также считается миокином, то есть цитокином, вырабатываемым мышечными клетками в ответ на мышечное сокращение и физическую нагрузку, стимулирующим липолиз, а также окисление жиров [85, 86]. Перепроизводство hIL-6 и других провоспалительных цитокинов связано с тяжелыми хроническими иммуноопосредованными воспалительными заболеваниями (IMID), такими как ревматоидный артрит [87] и атеросклероз [88]. Нарушение экспрессии hIL-6 также происходит во время нейродегенеративного процесса при болезни Альцгеймера [89], а высокие уровни этой молекулы связаны с рядом гиперпролиферативных заболеваний и прогрессированием рака [90, 91].

Белок hIL-6 был впервые выделен из супернатанта Т-клеточной линии, известной как TCL-Na1, трансформированной вирусом лейкемии [92], и впоследствии были исследованы его биохимические и функциональные характеристики [92]. , 93]. Нативный зрелый hIL-6 имеет две дисульфидные связи и сайт N-гликозилирования в Asn73, хотя гликан, по-видимому, не является существенным для биологической активности. Активность белка можно оценить in vitro путем тестирования стимуляции продукции IgM В-клетками SKW6-CL4, трансформированными вирусом Эпштейна-Барр (EBV) [92], или пролиферации мышиных BALB/c лимфоцитов или линии клеток мышиной гибридомы hIL-6 B9 или MH60 [94].

Рекомбинантные антитела и синтетические пептиды, нацеленные на hIL6 и предотвращающие взаимодействие с его рецептором (hIL-6R), являются полезными терапевтическими кандидатами при ревматоидном артрите, ювенильном идиопатическом артрите с системным началом (soJIA) и болезни Кастлемана [95, 96]. Разработка таких терапевтических молекул требует больших количеств функционального hIL-6, но из культур лимфоцитов можно выделить только небольшое количество нативного белка, то есть 3  мкг г чистого белка из 5.7 л культуральной среды [92]. Высокая стоимость рекомбинантного белка, полученного в E. coli (~ 10 000–15 000 евро/мг), означает, что необходимо рассмотреть альтернативные платформы. К настоящему времени рекомбинантный hIL-6 был получен в E. coli , P. pastoris , инфицированных бакуловирусом клетках насекомых и растениях табака.

Первые попытки экспрессии hIL-6 в E. coli включали использование плазмиды, полученной из pT9-11, с индуцируемым промотором Trp [97]. При попытке экспрессировать зрелый белок без сигнального пептида были обнаружены следовые количества hIL-6, но значительной сверхэкспрессии не наблюдалось.Затем к N-концу hIL-6 добавляли первые 20 аминокислот зрелого IL-2 (уже успешно сверхэкспрессированного в бактериальных клетках) вместе с сайтом расщепления калликреина. Химерный белок экспрессировался на высоких уровнях в тельцах включения с конечным выходом 0,4 г/л. Зрелая форма hIL-6 впоследствии экспрессировалась в виде телец включения с использованием синтетического гена с кодон-оптимизированной N-концевой частью с конечным выходом 0,55  г/л и расчетной чистотой ~60% [98, 99].

Два разных подхода были использованы для получения растворимого hIL-6 в E.coli , один с использованием системы экспрессии, предназначенной для секреции белка в периплазматическое пространство [100], а другой путем слияния белка с сигналом секреции бактериального α -гемолизинового сигнального пептида для секреции в культуральную среду [101]. В обоих случаях белок был получен в растворимой и активной форме, но с низкими выходами (10 мг/л и 70  мк г/л соответственно). Растворимый hIL-6 впоследствии был экспрессирован в штамме BL21 E. coli в виде гибрида с ОБМ, тиоредоксином, убиквитином или NusA, хотя успешными оказались только конструкции слияния ОБМ и NusA.Максимальный выход составил 7,5  г/л в биореакторной культуре, оптимизированной для варианта NusA [102]. Авторы не сообщали о каких-либо попытках удалить метку из гибридного белка и не предоставили никакой информации о биологической активности молекулы.

Совсем недавно набор конструкций hIL-6 с комбинациями N- и/или C-концевых меток (His 6 , T7, GST и сигнал периплазматической секреции щелочной фосфатазы E. coli ) был экспрессирован в различных Э.coli с восстанавливающими BL21 или окисляющими цитоплазматическими средами Origami 2, при различных температурах роста/индукции, в присутствии или отсутствии хелперных плазмид, кодирующих цитоплазматические шапероны [103]. Максимальный выход растворимого hIL-6 составил 2,6 мг/л и был достигнут при экспрессии цитоплазматического hIL-6 в клетках BL21 при 22°C в присутствии шаперонов. Рекомбинантный белок оказался активным, о чем свидетельствует его способность стимулировать мышиные гибридомные клетки.

Рекомбинантный hIL-6 также успешно экспрессировался в крупномасштабных культурах метилотрофных дрожжей P.пасторис [104]. кДНК зрелого белка клонировали в рамке считывания с сигналом секреции фактора α дрожжей под контролем индуцибельного промотора AOX1 (вектор pPICZalphaA) и вводили в штамм X33 P. pastoris . Было протестировано несколько условий культивирования и экспрессии как во встряхиваемых колбах, так и в крупномасштабном биореакторе. Максимальный выход был достигнут через 96 часов после индукции, достигая 30 и 280 мг/л во встряхиваемых колбах и биореакторе соответственно.Молекулярная масса очищенного hIL-6 составляла ~20,9 кДа, что указывает на отсутствие гликозилирования. Биоактивность hIL-6, продуцируемого в P. pastoris , была в пять раз выше, чем у коммерческого рекомбинантного hIL-6, продуцируемого в E. coli , при использовании для стимуляции роста лимфоцитов мыши BALB/c.

Первая попытка получения рекомбинантного hIL-6 в инфицированных бакуловирусом клетках насекомых включала экспрессию полноразмерной кДНК hIL-6 в модифицированном векторе Autographa californica вируса ядерного полиэдроза (AcNPV).Это было использовано для трансфекции клеток Sf9, что дало небольшое количество белка массой 22 кДа через 72 часа, и частичная очистка белка была необходима для установления его биологической активности [105]. Функциональный hIL-6 впоследствии экспрессировали в инфицированных бакуловирусом клетках Sf9 с использованием системы, основанной на индуцибельной секреции, но низкие выходы (1  мк г/мл) разочаровали [106].

Продуцирование функционального рекомбинантного hIL-6 в трансгенных растениях табака впервые было сообщено [107], но выход не был определен.Совсем недавно Nausch и соавт. [108] сравнили различные временные и стабильные стратегии экспрессии hIL-6 в табаке и N. benthamiana . Стабильная экспрессия тестировалась с использованием трех различных конструкций, нацеленных на апопласт, ER и вакуоль, каждая из которых контролировалась конститутивным промотором вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S. ER-сохраняемая версия hIL-6 накапливалась до гораздо более высоких уровней (на порядок выше), чем белки, нацеленные на апопласт и вакуоль, и поэтому была выбрана ER-сохраняющая конструкция.Три наиболее эффективных T0, экспрессирующих ER-сохраненный hIL-6, были подвергнуты самоопылению для получения потомства T1 и T2, увеличив урожай в наиболее продуктивной линии до 1397  μ г/г TSP (112  μ г/г сырой массы в листьях) и 1212  мкг/г г/г TSP (303  мкг/г г/г сухой массы в семенах) соответственно. Эту же конструкцию затем использовали для транзиторной экспрессии в двух сортах табака и в N. benthamiana с системой MagnICON. Были использованы две различные системы MagnICON: одна основана на РНК-зависимой РНК-полимеразе из вируса очищения жилок репы (TVCV) и белке оболочки вируса мозаики табака, заражающего крестоцветные (cr-TMV/TVCV), а другая полностью основана на . Вирус картофеля Х (ХВК).При использовании системы cr-TMV/TVCV у всех трех растений-хозяев наблюдалось только межклеточное перемещение, тогда как при использовании системы ХВК инфекция распространяется системно в N. benthamiana [109], но не в двух сортов табака. Самые высокие выходы были достигнуты у N. benthamiana , где hIL-6 накапливал до 7,8% TSP при использовании системы cr-TMV/TVCV и 4,8% TSP при использовании системы PVX. Значительно более низкие значения были достигнуты для табака с максимальным выходом около 1% TSP у сорта Вирджиния.Структурные и биологические свойства рекомбинантных белков были проверены с помощью вестерн-блоттинга, который показал, что hIL-6 растительного происхождения присутствует в виде двух гликоформ (26-27 кДа), хотя не проводилось никаких сравнений со структурой гликана нативного hIL-6. молекула. Активность рекомбинантного hIL-6 тестировали путем нанесения неочищенных экстрактов листьев на мышиные клетки B-9 и проведения анализа пролиферации гибридомы, показывая, что активность белков растительного происхождения была эквивалентна агликозилированному коммерческому стандарту hIL-6, полученному в г. Э.coli [94].

Стратегия обработки hIL-6 сильно зависит от природы исходного материала. Нерастворимый hIL-6, выделенный из телец включения E. coli , должен пройти несколько стадий солюбилизации/рефолдинга, основанных на окислении остатков цистеина с помощью окислительно-восстановительной пары, с последующим этапом рефолдинга разбавлением или гель-фильтрацией. Дополнительные стадии ионного обмена, ВЭЖХ с обращенной фазой и эксклюзионной хроматографии можно использовать для повышения чистоты продукта.Хотя с помощью этих методов можно выделить высокочистый (до 99%) активный hIL-6, эффективность часто бывает низкой, со степенью извлечения 15–20% [99]. Большое количество стадий очистки и низкий конечный выход в этих протоколах нерентабельны для промышленного производства, поэтому был разработан более простой протокол для выделения растворимого hIL-6, продуцируемого в P. pastoris [104]. Здесь белок был очищен из культурального супернатанта осаждением ПЭГ с последующей анионообменной и эксклюзионной хроматографией с конечным выходом 56% и чистотой до 95%.Стратегия очистки hIL-6, продуцируемого в растениях, еще не опубликована.

6. Выводы

В этом обзоре мы обсуждаем производство четырех рекомбинантных белков (hGAD65, NVLP, 2G12 и hIL-6), которые представляют собой гетерогенные фармацевтические приложения, различные биохимические характеристики и соответствующий широкий спектр производственных платформ. В таблице 1 представлен обзор продукции целевых белков в «традиционных» гетерологичных системах экспрессии. Мы сосредоточились не только на урожайности, достигаемой в различных производственных системах, но и на уникальных свойствах производственного процесса для каждого белка, тем самым подчеркивая преимущества растительных систем по сравнению с ферментерами для конкретных нишевых рынков.Это приводит к выводу, что растения потенциально наиболее полезны для производства четырех основных категорий фармацевтических белков: (1) фармацевтических белков, необходимых в больших количествах, то есть товарных фармацевтических белков, таких как микробицидные компоненты; (2) фармацевтических белков, которые необходимы для быстрого производства, то есть белки быстрого реагирования, такие как вакцины против быстро развивающихся вирусных штаммов; (3) биофармацевтические препараты, требующие сложных посттрансляционных модификаций, то есть антитела и рекомбинантные белки со специфическими гликановыми структурами; (4) биофармацевтические препараты, предназначенные для перорального применения. Доставка.

+

Рекомбинантный белок Гетерологическая система экспрессии Самый высокий уровень экспрессии Ссылка

hGAD65 кишечной палочки 12,5 мг / мл [15]
Saccharomyces cerevisiae 0,46 мг/мл [27]
Pichia Fastoris 2 10.42 мг/мл [27]
Spodoptera Frugiperda Клетки 0,02 мг/мл [18]
Myelma Cltlema
Myelma Cltlema
.
NVCP Escherichia coli * 56 мг/л [49]
Pichia pastoris * 10 мг/л [50]
Spodoptera Frugiperda * 125 мг/л [29]
8 [29]
8. [51]

2G12 гибридомных клонов 10 пг / клетку / день [60]

ГИП-6 кишечной палочки 7.5 мг / мл [102]
Pichia pastoris 0,28 мг / мл [104]
Spodoptera frugiperda клеток 0,001 мг / мл [106]

Приведенные значения представляют собой самые высокие данные о выходе очищенного или частично очищенного рекомбинантного белка из-за отсутствия данных об экспрессии.

Другие рекомбинантные белки растительного происхождения, помимо четырех описанных здесь целей, также подпадают под эти категории, например, вакцины против сезонных штаммов вируса (например, вакцины против сезонных штаммов вируса (например,например, полноразмерный белок гемагглютинина из штамма гриппа A/Wyoming/03/03 (h4N2) [110]), персонализированные вакцины (например, вакцины против неходжкинской лимфомы для отдельных пациентов [111]) и белки несущие специфические гликаны, повышающие их эффективность (например, человеческая глюкоцереброзидаза для заместительной ферментной терапии [112]).

Крупномасштабному производству рекомбинантных фармацевтических белков часто препятствует плохая экспрессия их зрелых активных форм в прокариотических хозяевах, таких как E.coli , а также высокой стоимостью и ограниченной масштабируемостью традиционных платформ на основе ферментеров с использованием клеток млекопитающих. Одним из наиболее интересных вопросов, возникающих в результате нашего индивидуального анализа, является высокая продуктивность растений по сравнению с другими платформами, когда учитываются как собственный урожай (на единицу биомассы), так и выход биомассы (на гектар в год). Это преимущество показано в таблице 2 для четырех тематических исследований, рассмотренных в этой статье, с точки зрения количества растений, необходимых для производства 1   г каждого целевого белка.Разнообразие доступных растений-хозяев и систем экспрессии обеспечивает разнообразный набор инструментов для производства рекомбинантных белков. Однако выбрать идеальную систему экспрессии на растительной основе непросто, поскольку необходимо тщательно рассмотреть многие аспекты, включая выход продукта, качество, масштабируемость производства, затраты и соответствие cGMP.

+

8
8
8
8
8
29 90 1 133 + 91 086 Nicotiana benthamiana + + 0.01001% ТСП

растения-хозяина растений органом Рекомбинантный белок Система экспрессии Самый высокий уровень экспрессии Растения / г рекомбинантного белка Ссылка

Табак (Nicotiana tabacum) Листья hGAD65mut Трансгенные 0.14 мг/г LFW 1 93 [23]
NVCP Трансгенные 0,2% ND [41]
[41]
[41]
[41]
[41]
[41]
[41]
[41]
1 119 [108]
2G12/2G12_KDEL Переходный процесс (бинарный вектор) 0,1 мг/г LFW
[78]
Семена hGAD67/65mut Трансгенные 0.4 мг/г СВХ 1 1250 [26]
IL6_KDEL Трансгенный 0,3 мг/г ТСВ 1 1667 [108]
2G12_KDEL / ЧЭЛ Трансгенные 1,0% ТСП ND [80]

Листья hGAD65mut Переходный процесс (векторы MagnICON) 0.1 мг/г LFW 2 3451 [23]
NVCP (VP1 и VP2) Переходный процесс (бинарный вектор) 1 мг/г ПВ 2 333 [57]
IL6_KDEL Переходные (MagnICON векторы) 7,8% ТСП ND [108]
2G12_KDEL Переходные (вирусный вектор) 0,12 мг / г LFW 2 2693 [79]

Arabidopsis Thaliana SEEDS HGAD67/65MUT.5 мг/г СВХ 3 308 [26]
2G12 Трансгенный 3,6 мг/г ТСВ 3 385 [75]
Листья 2G12 Трансгенные 0,2% ТСП ND [73]

Кукурузный (Zea Mays ) Семена 2G12 Трансгенные >0.1 мг / г ДСВ ND [76]

латук (Lactuca Sativa) Листья NVCP Переходные (вирусный вектор) 0,2 мг / г LFW ND [56]

Петуния (Petunia hybrida) Семена hGAD67 / 65mut Трансгенные 0,2 мг / г ДСВ ND [26]

Морковь (Daucus carota) Стержневые корни hGAD65 Трансгенные ND [22]

СЫатуйотопаз reinhardtii hGAD65 трансгенных 0,3% ТСП ND [20]

Растение картофеля (Lycopersicon esculentum) Плоды NVCP Трансгенный 0,16 мг/г 9059 масса плода 4 0.6 [53]

томатные (Solanum tuberosum) Клубни NVCP Трансгенные 0,12 мг / г клубня вес ND [53]

Максимальные уровни экспрессии указаны как масса рекомбинантного белка на единицу биомассы (LFW: листья, свежий вес; DSW: сухой вес семян), если только эти значения не были доступны, и в этом случае процент от общего вместо него используется растворимый белок (%TSP).Значения продуктивности рекомбинантного белка рассчитывали с учетом выхода биомассы семян или листьев на одно растение ( 1 [115]; 2 [59]; 3 [116]; 4 Сайт Университета штата Миссисипи: http:/ /msucares.com/crops/comhort/yield.html). ND: не определено (значения не рассчитывались из-за отсутствия данных о продуктивности или данные об экспрессии были указаны как %TSP).

В наших тематических исследованиях самые высокие урожаи были достигнуты в трансгенных растениях табака и при транзиентной экспрессии в N.Бентамиана . Например, hGAD65 экспрессируется на более высоких уровнях в N. benthamiana , чем в табаке (27,6 против 10,5  мк г/г сырой массы), но стабильно трансформированные растения табака в целом более продуктивны, поскольку они производят гораздо больше биомассы. Кроме того, накопление hGAD65mut в листьях табака превышает уровни, достигнутые у N. benthamiana (143,6 против 96,6  мк г/г сырой массы), что позволяет предположить, что продуктивность табака будет выше даже без учета повышенного производства биомассы. 23].Наоборот, накопление hIL-6 в N. benthamiana до 80 раз выше, чем при стабильной экспрессии в листьях и семенах табака [102].

Для надлежащей оценки требуются значимые сравнения между различными платформами, но это осложняется различными единицами измерения, используемыми для представления данных экспрессии. В наших четырех тематических исследованиях урожайность была указана как в абсолютных единицах (масса рекомбинантного белка на единицу биомассы, что позволяет рассчитать общую продуктивность с учетом масштаба производства), так и в относительных единицах (% TSP), что менее полезно, особенно при сравнении разнородных тканей, таких как листья и семена, с совершенно разным содержанием воды.Если предполагается, что затраты на последующую обработку одинаковы для всех платформ, предполагаемые затраты на производство рекомбинантных белков в растениях будут намного ниже, чем в современных технологиях, основанных на ферментации, из-за более низких затрат на начальном этапе [56]. Например, было оценено 140-кратное снижение затрат на производство hGAD65 в трансгенном табаке по сравнению с инфицированными бакуловирусом клетками насекомых [23].

В дополнение к гибкому и экономичному производству, предлагаемому растениями в целом, транзиентные системы экспрессии предлагают дополнительное преимущество быстрого масштабирования благодаря короткому интервалу между трансформацией и экспрессией.Мы использовали вакцину Norwalk virus в качестве тематического исследования, чтобы выделить эту нишу. Эффективная вакцина должна быть произведена быстро после идентификации штамма, чтобы остановить распространение нового штамма. NVLP, полученные путем временной экспрессии, решают эти проблемы, позволяя быстро и недорого производить штаммоспецифические вакцины своевременно и в соответствующих местах, включая развивающиеся страны [54, 55, 59, 110]. Тем не менее, следует также иметь в виду, что растения имеют преимущества при выращивании в небольших масштабах.Например, производство персонализированных вакцин в клетках млекопитающих потребует полной производственной кампании и «занятия» ферментера для каждого пациента, нуждающегося в вакцине. Напротив, временная экспрессия в растениях позволила бы приготовить многие аналогичные вакцины с использованием небольшого количества растений, каждое из которых помещено в защитную камеру в теплице. Таким образом, производство индивидуальной идиотипической вакцины против неходжкинской лимфомы было достигнуто менее чем за две недели после биопсии с использованием транзиентной экспрессии в растениях [111, 113].

Еще одним ключевым преимуществом растительных экспрессионных платформ является их способность синтезировать сложные эукариотические гликановые структуры. Считается, что примерно треть одобренных биофармацевтических препаратов представляют собой гликопротеины, что способствует использованию эукариотических систем для таких продуктов [114]. Хотя синтез N-гликанов в ER консервативен среди эукариот, процессинг N-гликанов в тельцах Гольджи различается между типами, что приводит к различным структурам гликанов. Гликопротеины растительного происхождения обычно содержат нечеловеческие гликаны, которые добавляются в тельце Гольджи [114].Являются ли эти гликаны иммуногенными или аллергенными, все еще остается предметом споров, но они могут быть иммунореактивными [70].

Два целевых белка, рассматриваемых в этом обзоре, являются гликозилированными: 2G12 и hIL-6. Антитело 2G12 было экспрессировано в широком диапазоне растительных платформ, включая системы дикого типа и гликоинженерные системы, и было нацелено на различные субклеточные компартменты, что привело к огромному разнообразию гликоформ. Подробное описание этих данных выходит за рамки данной статьи, но в целом было обнаружено, что различные профили гликанов не влияют на вируснейтрализующую активность антитела in vitro [72].Влияние различных гликоформ in vivo следует учитывать в будущих исследованиях, но вполне вероятно, что на Fc-опосредованные эффекторные функции антител и антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность могут влиять различные гликаны, и это следует рассматривать в контексте системного введения антител [70]. hIL-6 растительного происхождения также продуцировался в виде ряда различных гликоформ, каждая из которых обладала той же активностью in vitro , что и агликозилированный коммерческий аналог, продуцируемый в бактериях, но аналогично последствия in vivo необходимо оценить.Эти соображения менее важны, если фармацевтические препараты растительного происхождения предназначены для местного применения [117]. Важно отметить, что гликаны, специфичные для растений, также могут быть желательны в определенных случаях. Например, было показано, что наличие концевых остатков маннозы в рекомбинантной глюкоцереброзидазе растительного происхождения увеличивает ее поглощение макрофагами и, следовательно, ее эффективность при лечении болезни Гоше [112].

Одним из последних и уникальных преимуществ растительных систем является естественная «биоинкапсуляция», обеспечиваемая съедобными органами растений, когда фармацевтические препараты предназначены для перорального введения [45, 118].Предпочтение отдается пероральному введению лекарств [119], но незащищенные пептиды и белки подвергаются воздействию жесткой среды желудочно-кишечного тракта, которая является кислой и богатой протеолитическими ферментами. Для оральной вакцинации было проведено несколько клинических испытаний фазы I с использованием съедобных растений, включая те, которые экспрессируют NVLP, как обсуждалось выше [45]. Эти испытания подтвердили безопасность и иммуногенность NVLP без необходимости использования буфера или носителя, отличного от растительной клетки. Таким образом, трансгенные растения, экспрессирующие антигены, могут стать важным шагом на пути к цели разработки рентабельных и удобных вакцин.

Пероральный путь также является потенциально эффективной стратегией профилактики аутоиммунных заболеваний путем индукции толерантности. Например, пероральное введение растительной ткани, экспрессирующей hGAD65 (в сочетании с IL-4), мышиной модели T1D без ожирения с диабетом эффективно предотвращало начало заболевания [21]. Тем не менее, клиническое применение стратегий пероральной толерантности у людей было бы затруднительным из-за огромных затрат на производство аутоантигена, особенно если для поддержания положительных эффектов требуются повторные регулярные дозы.Растения могут удовлетворить этот беспрецедентный спрос на рекомбинантные аутоантигены, делая такие стратегии безопасными, привлекательными и экономически целесообразными.

Примеры, рассмотренные выше, можно рассматривать как подтверждающие пример, которые подчеркивают некоторые конкретные преимущества производственных платформ на основе растений по сравнению с традиционными системами. Маловероятно, что растения полностью заменят клетки CHO и другие устоявшиеся системы, но в настоящее время они прочно закрепляются на нишевых рынках, где уникальные преимущества растений дают наибольшие преимущества.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

Вклад авторов

Матильда Мерлен и Элиза Геккеле в равной степени соавторы этой статьи.

Перевод: Сделать синтез белка возможным

Синтез белка осуществляется посредством процесса, называемого трансляцией. После того, как ДНК транскрибируется в молекулу информационной РНК (мРНК) во время транскрипции, мРНК должна быть переведена для получения белка.При трансляции мРНК вместе с транспортной РНК (тРНК) и рибосомами работают вместе для производства белков.

Стадии трансляции в синтезе белка

  1. Инициация: Субъединицы рибосом связываются с мРНК.
  2. Удлинение:  Рибосома движется вдоль молекулы мРНК, связывая аминокислоты и образуя полипептидную цепь.
  3. Завершение:  Рибосома достигает стоп-кодона, который прекращает синтез белка и высвобождает рибосому.

Транспортная РНК

Транспортная РНК играет огромную роль в синтезе и трансляции белка. Его работа заключается в переводе сообщения в нуклеотидной последовательности мРНК в определенную последовательность аминокислот. Эти последовательности соединяются вместе, образуя белок. Транспортная РНК имеет форму листа клевера с тремя петлями. Он содержит сайт присоединения аминокислоты на одном конце и специальный участок в средней петле, называемый сайтом антикодона. Антикодон распознает определенную область мРНК, называемую кодоном.

Модификации матричной РНК

Трансляция происходит в цитоплазме. Покинув ядро, мРНК перед трансляцией должна пройти несколько модификаций. Участки мРНК, не кодирующие аминокислоты, называемые интронами, удаляются. К одному концу мРНК присоединяется поли-А-хвост, состоящий из нескольких адениновых оснований, а к другому концу — гуанозинтрифосфатный кэп. Эти модификации удаляют ненужные участки и защищают концы молекулы мРНК.После завершения всех модификаций мРНК готова к трансляции.

Перевод

При трансляции мРНК вместе с тРНК и рибосомами работают вместе, чтобы произвести белок.

Мариана Руис Вильярреал/Wikimedia Commons

Как только информационная РНК модифицирована и готова к трансляции, она связывается с определенным сайтом на рибосоме. Рибосомы состоят из двух частей: большой субъединицы и малой субъединицы. Они содержат сайт связывания мРНК и два сайта связывания транспортной РНК (тРНК), расположенные в большой субъединице рибосомы.

Посвящение

Во время трансляции небольшая субъединица рибосомы присоединяется к молекуле мРНК. В то же время молекула инициирующей тРНК распознает и связывается с определенной последовательностью кодонов на той же молекуле мРНК. Затем к новообразованному комплексу присоединяется крупная рибосомная субъединица. Инициаторная тРНК находится в одном сайте связывания рибосомы, называемом сайтом P , оставляя открытым второй сайт связывания, сайт A . Когда новая молекула тРНК распознает следующую последовательность кодонов на мРНК, она присоединяется к открытому сайту A .Образуется пептидная связь, соединяющая аминокислоту тРНК в сайте P с аминокислотой тРНК в сайте связывания A .

Удлинение

Когда рибосома движется вдоль молекулы мРНК, тРНК в сайте P высвобождается, а тРНК в сайте A перемещается в сайт P . Сайт связывания A снова становится вакантным до тех пор, пока другая тРНК, распознающая новый кодон мРНК, не займет открытое положение.Этот паттерн продолжается по мере того, как молекулы тРНК высвобождаются из комплекса, присоединяются новые молекулы тРНК и растет цепь аминокислот.

Прекращение

Рибосома будет транслировать молекулу мРНК, пока не достигнет терминирующего кодона мРНК. Когда это происходит, растущий белок, называемый полипептидной цепью, высвобождается из молекулы тРНК, и рибосома вновь распадается на большие и малые субъединицы.

Новообразованная полипептидная цепь претерпевает несколько модификаций, прежде чем стать полностью функционирующим белком.Белки выполняют множество функций. Некоторые из них будут использоваться в клеточной мембране, а другие останутся в цитоплазме или будут транспортироваться из клетки. Из одной молекулы мРНК может быть получено множество копий белка. Это связано с тем, что несколько рибосом могут транслировать одну и ту же молекулу мРНК одновременно. Эти кластеры рибосом, которые транслируют одну последовательность мРНК, называются полирибосомами или полисомами.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.