Мальцева 1: Платные услуги – БУЗ ВО «Вологодская городская поликлиника №1»

Содержание

Прайс-лист Вологодская городская поликлиника № 1

Приемы (осмотры, консультации) специалистов

Прием (осмотр, консультация) врача-аллерголога-иммунолога первичный 600

Прием (осмотр, консультация) врача-аллерголога-иммунолога повторный 500

Прием (осмотр, консультация) врача-гастроэнтеролога первичный 600

Прием (осмотр, консультация) врача-гастроэнтеролога 1-й категории первичный 700

Прием (осмотр, консультация) врача-гастроэнтеролога повторный 500

Прием (осмотр, консультация) врача-гематолога первичный 600

Прием (осмотр, консультация) врача-гематолога повторный 500

Прием (осмотр, консультация) врача-дерматовенеролога первичный 600

Прием (осмотр, консультация) врача-дерматовенеролога повторный 500

Прием (осмотр, консультация) врача-дерматовенеролога на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача-невролога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-невролога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-невролога на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача-онколога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-онколога 2-й категории первичный650

Прием (осмотр, консультация) врача-онколога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-онколога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-кардиолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-кардиолога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-кардиолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-акушера-гинеколога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-акушера-гинеколога высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-акушера-гинеколога повторный500

Прием (осмотр) врача-акушера-гинеколога консультативный350

Прием (осмотр, консультация) врача-оториноларинголога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-оториноларинголога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-оториноларинголога высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-оториноларинголога (Заслуженный врач РФ) первичный900

Прием (осмотр, консультация) врача-оториноларинголога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-оториноларинголога на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача-офтальмолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-офтальмолога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-офтальмолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-офтальмолога на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача-профпатолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-профпатолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-терапевта первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-терапевта 2-й категории первичный650

ПрПрием (осмотр, консультация) врача-терапевта 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-терапевта высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-терапевта повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-терапевта на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача общей практики (семейного врача) первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача общей практики (семейного врача) повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача общей практики (семейного врача) на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача — травматолога- ортопеда первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-травматолога-ортопеда 2-й категории первичный650

Прием (осмотр, консультация) врача-травматолога-ортопеда 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-травматолога-ортопеда высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача — травматолога-ортопеда повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-уролога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-уролога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-уролога высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-уролога (Заслуженный врач РФ) первичный900

Прием (осмотр, консультация) врача-уролога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-хирурга первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-хирурга 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-хирурга 2-й категории первичный650

Прием (осмотр, консультация) врача-хирурга повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-хирурга на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача-эндокринолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-эндокринолога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-эндокринолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-эндокринолога на дому1 400

Прием (осмотр, консультация) врача-колопроктолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-колопроктолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-сердечно-сосудистого хирурга первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-сердечно-сосудистого хирурга высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-сердечно-сосудистого хирурга 2-й категории первичный650

Прием (осмотр, консультация) врача-сердечно-сосудистого хирурга повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-нейрохирурга первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-нейрохирурга высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-нейрохирурга повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-нефролога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-нефролога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-инфекциониста первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-инфекциониста повторный500

Осмотр (консультация) врача-физиотерапевта первичный600

Осмотр (консультация) врача-физиотерапевта повторный500

Прием (тестирование, консультация) медицинского психолога первичный600

Прием (тестирование, консультация) медицинского психолога повторный500

Прием (тестирование, консультация) медицинского психолога индивидуальное занятие650

Прием (тестирование, консультация) медицинского психолога групповые занятия (7 сеансов)700

Прием (осмотр, консультация) врача-рефлексотерапевта первичный600

Прием (осмотр, консультация) диетолога первичный850

Прием (осмотр, консультация) диетолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-трихолога (дерматовенеролога) первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-трихолога (дерматовенеролога) повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача по лечебной физкультуре  первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача по лечебной физкультуре  повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-пульмонолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-пульмонолога 1-й категории первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-пульмонолога высшей категории первичный800

Прием (осмотр, консультация) врача-пульмонолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-ревматолога первичный600

Прием (осмотр, консультация) врача-ревматолога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-сурдолога-оториноларинголога первичный700

Прием (осмотр, консультация) врача-сурдолога-оториноларинголога (Заслуженный врач РФ) первичный900

Прием (осмотр, консультация) врача-сурдолога-оториноларинголога повторный500

Прием (осмотр, консультация) врача-кардиолога (с функцией сомнолога)700

Информация об изменениях ИП Мальцева Елена Николаевна (ИНН 713302361847)

05.10.2020

Присвоен ОКВЭД “45.20 ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБСЛУЖИВАНИЕ И РЕМОНТ АВТОТРАНСПОРТНЫХ СРЕДСТВ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.82.1 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ В НЕСТАЦИОНАРНЫХ ТОРГОВЫХ ОБЪЕКТАХ ТЕКСТИЛЕМ, ОДЕЖДОЙ И ОБУВЬЮ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.75.3 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ПРЕДМЕТАМИ ЛИЧНОЙ ГИГИЕНЫ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.75.2 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ТУАЛЕТНЫМ И ХОЗЯЙСТВЕННЫМ МЫЛОМ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.75.1 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ КОСМЕТИЧЕСКИМИ И ПАРФЮМЕРНЫМИ ТОВАРАМИ, КРОМЕ МЫЛА В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.72.1 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ОБУВЬЮ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.71.8 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ АКСЕССУАРАМИ ОДЕЖДЫ (ПЕРЧАТКАМИ, ГАЛСТУКАМИ, ШАРФАМИ, РЕМНЯМИ, ПОДТЯЖКАМИ И Т. П.) В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.71.7 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ГОЛОВНЫМИ УБОРАМИ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.71.6 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ЧУЛОЧНО-НОСОЧНЫМИ ИЗДЕЛИЯМИ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.71.5 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ СПОРТИВНОЙ ОДЕЖДОЙ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.71.2 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ НАТЕЛЬНЫМ БЕЛЬЕМ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.71.1 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ МУЖСКОЙ, ЖЕНСКОЙ И ДЕТСКОЙ ОДЕЖДОЙ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.65 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ИГРАМИ И ИГРУШКАМИ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.62.2 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ПИСЧЕБУМАЖНЫМИ И КАНЦЕЛЯРСКИМИ ТОВАРАМИ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

22.02.2019

Присвоен ОКВЭД “47.62.1 ТОРГОВЛЯ РОЗНИЧНАЯ ГАЗЕТАМИ И ЖУРНАЛАМИ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МАГАЗИНАХ 2014”

Самарский завод КВОиТ, ЗАО на карте Самары пр-д. Мальцева, 1

оставить отзыв 443022, Самара,
проезд Мальцева, 1

8 (846) 979-96-01,
8 (846) 979-96-03

8 (846) 979-96-02

[email protected]


Как доехать на общественном транспорте:

Ближайшие станции метро:

http://www.kvoit-samara.ru

Последний отзыв:

Об этой компании еще нет ни одного отзыва

  • Металлоизделия;
  • Металлоконструкции

Данные об организации «Самарский завод КВОиТ, ЗАО» размещены в справочнике Самары в рубриках «Металлоизделия», «Металлоконструкции». «Самарский завод КВОиТ, ЗАО» зарегистрирована по адресу Самара, проезд Мальцева, 1. Связаться с администрацией можно по телефонам 8 (846) 979-96-01 , 8 (846) 979-96-03. Сайт http://www.kvoit-samara.ru


БУЗ «Вологодская городская поликлиника №1» (ул. Мальцева, д. 45) г. Вологда

Акулинина О. В. Терапевт Расписание отсуствует
Бабуренкова Т. Д. Терапевт Расписание отсуствует
Байдина Я. Э. Терапевт Расписание отсуствует
Барболина А. В. Врач-лаборант Расписание отсуствует
Белов В. А. Ультразвуковой диагност Расписание отсуствует
Беничева Т. В. Терапевт Расписание отсуствует
Богдан Р. В. Уролог Расписание отсуствует
Бойко И. Н. Врач общей практики Расписание отсуствует
Бойцева О. Ю. Врач общей практики Расписание отсуствует
Большакова Т. В. Терапевт Расписание отсуствует
Буджиашвили Г. И. Уролог Расписание отсуствует
Бутакова А. Ю. Дерматовенеролог Расписание отсуствует
Валюженич В. Ю. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Ваниев Р. И. Хирург Расписание отсуствует
Васильев Е. М. Аллерголог-иммунолог Расписание отсуствует
Васильева А. О. Функциональный диагност Расписание отсуствует
Вопилова Ю. А. Терапевт Расписание отсуствует
Воробьева Е. В. Врач-лаборант Расписание отсуствует
Ворошилова В. А. Врач общей практики Расписание отсуствует
Ганичева В. И. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Гладкова Г. П. Эндокринолог Расписание отсуствует
Горчаков Р. А. Врач общей практики Расписание отсуствует
Гуричева О. А. Инфекционист Расписание отсуствует
Гурская Н. Б. Оториноларинголог (лор) Расписание отсуствует
Демидова В. Н. Терапевт Расписание отсуствует
Джганджгава Н. Р. Невролог (Невропатолог) Расписание отсуствует
Дзык М. В. Психотерапевт Расписание отсуствует
Должников С. В. Оториноларинголог (лор) Расписание отсуствует
Дубова А. С. Терапевт Расписание отсуствует
Дякивнич Т. К. Функциональный диагност Расписание отсуствует
Епифанцев О. Ю. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Железный Н. Г. Хирург Расписание отсуствует
Забелина М. В. Врач общей практики Расписание отсуствует
Захарова С. Е. Рентгенолог Расписание отсуствует
Зерин А. В. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Иванова Г. Г. Терапевт Расписание отсуствует
Игнатьевский С. Н. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Ильина Н. Е. Терапевт Расписание отсуствует
Истоцкая Н. Н. Терапевт Расписание отсуствует
Казарина Т. М. Пульмонолог Расписание отсуствует
Кацал В. В. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Кируша Н. Н. Терапевт Расписание отсуствует
Кодачигова О. П. Эндокринолог Расписание отсуствует
Коканова Н. О. Терапевт Расписание отсуствует
Коновалова Г. В. Врач общей практики Расписание отсуствует
Константинов О. А. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Кочнев А. В. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Кошелева И. В. Терапевт Расписание отсуствует
Крылов И. Г. Нефролог Расписание отсуствует
Ксенофонтова В. Г. Врач общей практики Расписание отсуствует
Кудрякова Н. А. Врач общей практики Расписание отсуствует
Кузьмина В. И. Терапевт Расписание отсуствует
Курышева А. И. Терапевт Расписание отсуствует
Левина Т. И. Терапевт Расписание отсуствует
Лобашева Е. Г. Эндокринолог Расписание отсуствует
Макарова Г. Л. Врач-лаборант Расписание отсуствует
Малафеев М. М. Рентгенолог Расписание отсуствует
Маркевич Ю. Н. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Матаруев С. С. Хирург Расписание отсуствует
Мельникова Н. Б. Дерматовенеролог Расписание отсуствует
Микуев Ф. А. Хирург Расписание отсуствует
Мыльников О. В. Рентгенолог Расписание отсуствует
Наумов А. Б. Невролог (Невропатолог) Расписание отсуствует
Ниденфюр В. Д. Невролог (Невропатолог) Расписание отсуствует
Носова Л. В. Офтальмолог (окулист) Расписание отсуствует
Овсянникова С. А. Акушер-гинеколог Расписание отсуствует
Пантюхин О. А. Невролог (Невропатолог) Расписание отсуствует
Перова С. Н. Врач общей практики Расписание отсуствует
Пестовская В. С. Ультразвуковой диагност Расписание отсуствует
Погодина О. Н. Врач общей практики Расписание отсуствует
Попов А. А. Рефлексотерапевт Расписание отсуствует
Рожина Т. П. Акушер-гинеколог Расписание отсуствует
Рубцова Т. А. Терапевт Расписание отсуствует
Семьянихина Т. А. Нейрохирург Расписание отсуствует
Сергиевская Г. В. Кардиолог Расписание отсуствует
Серебрякова А. А. Врач общей практики Расписание отсуствует
Сидорова С. Х. Врач-лаборант Расписание отсуствует
Скрипник Т. В. Физиотерапевт Расписание отсуствует
Скрябина М. В. Оториноларинголог (лор) Расписание отсуствует
Слабенко Н. И. Терапевт Расписание отсуствует
Смирнова Е. А. Ультразвуковой диагност Расписание отсуствует
Смирнова М. Л. Ревматолог Расписание отсуствует
Тарасовский В. В. Хирург Расписание отсуствует
Толстикова Л. А. Офтальмолог (окулист) Расписание отсуствует
Тропина О. А. Терапевт Расписание отсуствует
Туманис О. А. Врач лечебной физкультуры Расписание отсуствует
Хохлова Г. Н. Терапевт Расписание отсуствует
Хрусталева Г. Н. Ортопед-травматолог Расписание отсуствует
Чуркина А. Г. Терапевт Расписание отсуствует
Шаткина И. В. Врач общей практики Расписание отсуствует
Шипицин Е. А. Рентгенолог Расписание отсуствует
Юдина Ю. Е. Акушер-гинеколог Расписание отсуствует
Юрикова А. К. Рентгенолог Расписание отсуствует
Юрченко В. С. Терапевт Расписание отсуствует
Янченко Н. Г. Функциональный диагност Расписание отсуствует
Янченко Н. П. Терапевт Расписание отсуствует

Мальцева Инна Владиславовна

Мальцева Инна Владиславовна

Доцент , Кандидат технических наук

 Биография и награды

В 2001 году окончила Ростовский государственный строительный университет по специальности «Производство строительных материалов, изделий и конструкций». В 2004 г. закончила аспирантуру при кафедре «Строительные материалы» РГСУ и в 2005г успешно защитила кандидатскую диссертацию.

С 2001 по 2009г. работала в ООО «РосСтройМикс» технологом. С февраля 2009г. и по настоящее время работает в должности доцента кафедры строительных материалов Донского государственного технического университета.

Обладает уникальным сочетанием глубоких теоретических и практических знаний в области производства строительных материалов, изделий и конструкций. Подготовила 2 учебных пособия, несколько методических указаний, рабочих программ и учебно-методических комплексов. Научные разработки были представлены на международных научно-практических конференциях.

Образование

2001 г.

Ростовский государственный строительный университет, Производство строительных материалов, изделий и конструкций

2001 г.

Ростовский государственный строительный университет, магистр техники и технологии по направлению «Строительство»

2005 г.

Ростовский государственный строительный университет, диплом кандидата технических наук по специальности 05.23.05 Производство строительных материалов, изделий и конструкций

Преподаваемые дисциплины

Строительные материалы

Материаловедение

Химия в строительстве

Основы строительного материаловедения

Профессиональный опыт

2001-2009 гг.

– технолог ООО «РосСтройМикс»

2009 – 2010 гг.

– ассистент кафедры «Строительные материалы» РГСУ

2010-2014 гг.

– старший преподаватель кафедры «Строительные материалы» РГСУ

2014-настоящее время

– доцент кафедры «Строительные материалы» РГСУ, ДГТУ

Стаж работы

17 лет

Стаж работы по специальности

17 лет

Научные интересы

Керамические материалы и изделия, сухие строительные смеси,

энерго- и ресурсосберегающие технологии производства строительных материалов, изделий и конструкций

Повышение квалификации и (или) профессиональная подготовка

2014 – Правила контроля и оценки прочности бетона неразрушающими методами

2015 – Контроль за качеством объектов строительства

2016 – Стратегия развития регионального бизнеса

Публикации

Использование техногенных отходов в производстве ячеистых материалов

Научное обозрение.- Москва, 2014, № 11

Современные подходы к технологии отделки ячеистобетонных изделий

Строительство и архитектура — 2015 материалы международной научно-практической конференции. ФГБОУ ВПО «Ростовский государственный строительный университет», Союз строителей южного федерального округа, Ассоциация строителей Дона. 2015

Эффективная эластичная гидроизоляция

СТРОИТЕЛЬСТВО — 2015: СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ СТРОИТЕЛЬСТВА материалы международной научно-практической конференции. ФГБОУ ВПО «Ростовский государственный строительный университет», Союз строителей южного федерального округа, Ассоциация строителей Дона. 2015

Влияние вещественного состава глинистого сырья на свойства пенокерамических масс

СТРОИТЕЛЬСТВО — 2015: СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ СТРОИТЕЛЬСТВА материалы международной научно-практической конференции. ФГБОУ ВПО «Ростовский государственный строительный университет», Союз строителей южного федерального округа, Ассоциация строителей Дона. 2015

Мелкозернистые конструкционно-теплоизоляционные легкие бетоны на заполнителе из зольных микросфер

Научное обозрение. – Москва, 2015. № 20.

Обратиться за помощью в трудоустройстве теперь можно в МФЦ Вологды и Вологодского района

Между МФЦ Вологды и региональным Центром занятости населения заключено соглашение о взаимодействии. С апреля в МФЦ Вологды и Вологодского района в секторе пользовательского сопровождения сотрудники областного центра занятости будут консультировать граждан по поиску подходящей работы, а работодателей – по подбору необходимых работников.

Кроме того, специалисты окажут содействие и тем, и другим в подаче заявления в электронной форме на Единой цифровой платформе в сфере занятости и трудовых отношений «Работа в России». Также в МФЦ вологжане смогут получить помощь в сопровождении при направлении заявления о содействии в трудоустройстве.

За консультацией к специалисту Центра занятости можно будет обратиться в МФЦ, расположенные на территории Вологды по адресам: ул. Мира, д. 1, ул. Мальцева, д. 52, ул. Герцена, д. 63а. Прием будет осуществляться ежедневно с 8.00 до 12.00 и с 13.00 до 17.00 с понедельника по пятницу.

Организацию работы по консультированию граждан в офисе МФЦ на Мальцева, 52 проверил заместитель Губернатора области Виталий Тушинов.

«Основная цель этого нововведения – повысить доступность и удобство обращений граждан в службу занятости. Сам по себе механизм очень простой – специалист центра занятости в МФЦ проконсультирует и поможет человеку зарегистрироваться на портале «Работа в России». Соответственно, если приходит работодатель – ему окажут консультацию для того, чтобы начать поиск того специалиста, который ему нужен, – отметил Виталий Тушинов. – Теперь жителям Вологды не обязательно ехать непосредственно в центр занятости на Конева, получить необходимую консультацию по вопросам трудоустройства они смогут в любом удобном для них офисе МФЦ».

Большим плюсом также является и то, что в МФЦ жители могут сразу оформить такие документы, как ИНН, СНИЛС и справка о наличии или отсутствии судимости, которые пригодятся для трудоустройства.

Напомним, что с начала этого года за содействием в поиске работы в региональную службу занятости уже обратилось более четырех тысяч граждан, сообщает пресс-служба Правительства Вологодской области.

Разложение продуктов дехлорирования Aroclor 1242 в отложениях Burkholderia xenovorans LB400(ohb) и Rhodococcus sp. Штамм RHA1(fcb)

Abstract

Штамм LB400 Burkholderia xenovorans , обладающий бифенильным путем, был сконструирован так, чтобы содержать оксигенолитический орто--дегалогенирующий оперон ( ohb ), что позволяет ему расти на 2-хлорбензоатных цепях. полностью минерализовать 2-хлорбифенил. Был смоделирован двухстадийный процесс анаэробной/аэробной биоочистки осадка, загрязненного Aroclor 1242, а также исследована активность разложения и генетическая стабильность LB400( ohb ) и ранее сконструированного штамма RHA1( fcb ), способного расти на 4-х хлорбензоата, контролировали во время аэробной фазы.За динамикой популяции обоих штаммов также следили с помощью селективного посева и ПЦР в реальном времени с сопоставимыми результатами; популяции обоих рекомбинантов увеличивались в загрязненных осадках. Инокуляция при различной плотности клеток (10 4 или 10 6 клеток г -1 осадка) не влияла на степень биодеградации полихлорированного бифенила (ПХБ). Через 30 дней степень удаления ПХБ при высокой и низкой плотности инокуляции составила 57% и 54% соответственно во время аэробной фазы.

Приблизительно 635 миллионов кг полихлорированных дифенилов (ПХБ) было произведено в США с 1929 по 1978 год, и такое же количество было произведено в Японии, Европе и бывшем СССР (19). По оценкам, 31% от общего количества был выброшен в окружающую среду, загрязняя почву и отложения (16). Высокая гидрофобность молекул ПХБ способствует их накоплению в видах более высокого трофического уровня и их долгосрочному сохранению в окружающей среде.

За последние 30 лет исследования ПХБ показали, что эти соединения, ранее считавшиеся неподатливыми, могут разлагаться как анаэробными, так и аэробными бактериями.В анаэробных условиях анаэробные микробные консорциумы превращают высокохлорированные конгенеры в менее хлорированные бифенилы путем восстановительного дехлорирования, оставляя кольца нетронутыми (3, 7, 30, 31). В аэробных условиях некоторые микроорганизмы с более разнообразными окислительными способностями могут расщеплять меньшие хлорированные бифенильные кольца с образованием хлорированных бензоатов и производных пентановой кислоты (28), которые часто разлагаются другими бактериями. Следовательно, последовательный анаэробный/аэробный микробный процесс может привести к полному биоразложению ПХБ (25).Такая последовательность может обеспечить естественную аттенюацию на аэробно-анаэробных границах (9), а также превратиться в технологию биоремедиации ПХБ (37, 39).

Из-за их способности воздействовать на широкий спектр конгенеров ПХД, Burkholderia xenovorans LB400 и Rhodococcus sp. Штамм RHA1 являются двумя наиболее многообещающими штаммами для использования на аэробной стадии процесса биоочистки ПХБ. Однако, как и другие микроорганизмы, разлагающие ПХД, в лучшем случае они имеют ограниченную способность расти на ПХД (29), поэтому для биологической очистки потребуются повторные добавки (биоаугментация).Оба штамма накапливают хлорбензоаты в процессе разложения ПХБ. Мы пришли к выводу, что, добавив гены для дехлорирования хлорбензоатов, мы могли бы позволить этим штаммам достаточно хорошо расти на ПХБ, чтобы избежать повторной биоаугментации. Ранее мы продемонстрировали этот подход, раздельно перенося орто- ( ohb ) и para ( fcb ) хлорбензоат-дехлорирующие гены в Comamonas testosteroni VP44, получая конструкции, способные расти на 4-хлорбензоате (4-CBA ) и 4-хлорбифенил (4-ХБ) или 2-ХБК и 2-ХБ (17).Точно так же мы перенесли генов fcb в RHA1, что позволило ему расти на 4-CBA и 4-CB (33).

Несмотря на то, что было проведено множество экспериментов по проверке способности различных аэробных бактерий разлагать ПХД, в большинстве работ использовался только один конгенер (27), использовалось свеженанесенное загрязняющее вещество (21) и/или проводились в условиях покоящейся клетки. (1, 26). Предоставляя полезную информацию, эти типы экспериментов не отражают условий, при которых аэробные бактерии должны работать в процессе биологической очистки от ПХД.Участки, загрязненные ПХБ, содержат полный спектр конгенеров, происходящих из разливов Ароклора, и длительное время, которое они обычно должны были разделить в почве или органическом веществе отложений, делает их менее биодоступными, чем ПХД со свежими добавками. Кроме того, бактериальные штаммы, разлагающие ПХД, добавленные в почву или отложения, загрязненные ПХД, должны эффективно конкурировать с местными почвенными микроорганизмами. Эти факторы необходимо учитывать при оценке пригодности аэробных микроорганизмов, разлагающих ПХБ, для использования в процессе биологической очистки.

Представленная здесь работа является расширением нашего подхода к добавлению способности к разложению хлорбензоата компетентным микроорганизмам, разлагающим ПХБ, в сочетании с оценкой конструкций, полученных для использования на аэробной стадии последовательного процесса анаэробной/аэробной биологической очистки от ПХБ. Мы ввели генов ohb в LB400 и протестировали конструкцию сначала на ее способность расти на 2-хлорбензоате, а затем на ее способность разлагаться и расти на выбранных конгенерах ПХД, обычно образующихся в результате микробного дехлорирования Aroclors.Наконец, мы смоделировали последовательный процесс анаэробной/аэробной биоочистки путем дехлорирования Ароклора 1242 в суспензиях анаэробных отложений, создания аэробных условий и совместного добавления LB400 ( ohb ) и RHA1 ( fcb ) к отложениям. Конструкции оставались генетически стабильными и разлагали 57% оставшихся ПХБ, увеличивая их количество, успешно конкурируя с местными бактериями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и условия культивирования.

В этом исследовании использовались штаммы Rhodococcus sp. штамм RHA1 (24), Burkholderia xenovorans LB400 (6) и Escherichia coli JM109 (Promega Corp., Мэдисон, Висконсин). Рекомбинантные клетки выращивали на синтетической среде К1 (41), содержащей 2 мМ 2- или 4-ХБК или 3 мМ бифенила (номинальная концентрация), при необходимости добавляли 10 мкг/мл тетрациклина. Агаровые чашки Луриа-Бертани (LB), содержащие рифампин (50 мкг/мл), использовали для повторного выделения клеток из 10-кратных разведений осадков (33).

Конструирование рекомбинантных штаммов.

Ранее был разработан грамположительный/грамотрицательный челночный вектор pRT1, который использовался для трансформации Rhodococcus sp. штамм RHA1 с опероном fcbABC , что позволяет ему расти на 4-CBA (33). Гены Pseudomonas aeruginosa 142 ohbABCR (фрагмент XbaI-KpnI размером 3,7 т.п.н.) (38) были субклонированы из плазмиды pE43 в плазмиду pRT1, в результате чего была получена плазмида pRO41 (таблица). Этот клон придает способность расти на 2-CBA.Рестрикционные и ДНК-модифицирующие ферменты получали от New England Biolabs (Beverly, MA) и использовали в соответствии с инструкциями производителя. Таблица 1 PRT1 грамположительный / граммотный трансферный шаттл, содержащий репликтон RC1 33 PROHD34 PROHD34 THE 30096, но содержащий генов FCBABC 33 PE43 PE43 POOD33 производные, содержащие Джены 38 Pro41 Pro41, что и PRT1, но содержащие гены ОБУБ от PE43 Эта работа штаммов      Escherichia coli JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR 17 SUPE44 RELA1 λ Δ ( Lac-Proab ) [ F Truct36 Proab LACL Q Z Δ M15 ] Promega Corp.      Rhodococcus sp. Штамм RHA1 ( FCB ) рекомбинантные 4-хлорбензоат деградры, Rif R 3 3 Burkolderia Xenovorans LB400 ( OHB ) Recombinant 2-хлорбензоаттериата деградара, RIF R Эта работа A A 1 (2,159-2,175) GTT Gat CGC CGC CAA TG 32 Taqman FCB (2139 -2,157) Fam-CGG CTT CTC GAT CCG CGC C-TAMRA 32 Reverse FCB (2,115-2,135) TGG TAC GGC AGG TGT A 32 вперед ohb (3,054-3,051) CGA CCG CAT CGT CTC CTT Эта работа     Taqman ohb (3,056-909AM) 9008 CAC GCC AAC ACC TAC TCC CAA CAC GC-TAMRA Эта работа Reverse Reverse OHB (3,101-3,118) GGC TTT CAC GCG CAC att Эта работа F599 FCB B ( 2 068-2090) GGT CCA GCG CGA AAT CCA GTC 33 R599 FCB B (2 647-2,666) CCC CCG CAC ACC GCA TCA AG 5 33 F580 OHB (3,321-3,344) GCG GAC AAG CGT TTC GAT ACA GGA Эта работа R580 OHB (3877-3899) GCT TGC AGT TGC GCT TGA TGA T Эта работа

Плазмида pRO41 была очищена от E.coli с помощью набора Wizard miniprep (Promega Corp., Мэдисон, Висконсин) и трансформировали в LB400 с помощью электропорации (33). Трансформированные клетки отбирали на LB, содержащем тетрациклин (10 мкг/мл), и реплики высевали на среду K1 с добавлением бифенила или 2-CBA в качестве источника углерода.

Анализ роста на 2-CBA.

Трансформанты инокулировали в синтетическую среду K1, содержащую 3 мМ 2-CBA. Культуры инкубировали в двух повторностях при 30°С на ротационном шейкере при 150 об/мин. Рост измеряли как увеличение оптической плотности при 600 нм (OD 600 ).Выделение хлоридов анализировали колориметрически (4). Исчезновение субстрата контролировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (23).

Анализ роста на синтетических смесях ПХБ М и С.

Исходные ацетоновые растворы смесей М и С содержали восемь более распространенных конгенеров ПХБ, присутствующих в образцах М и С, соответственно, в приблизительных пропорциях, наблюдаемых в лабораторных экспериментах, генерирующих образцы М и С. C-профили из Aroclor 1242 (42). Концентрация конгенеров в смеси М (мкмоль/мл ацетона) была следующей: 2-ХБ, 8.0; 4-СВ, 2,1; 2,4-ЦБ, 1,4; 2,6-ЦБ, 3,6; 2,2′-ЦБ, 10,8; 2,4′-ЦБ, 12,3; 2,2′,4-ЦБ, 6,4; и 2,4,4′-CB, 5.4. Концентрации в смеси C были следующими: 2-CB, 25,0; 4-СВ, 2,5; 2,4-ЦБ, 0,5; 2,6-ЦБ, 5,0; 2,2′-ЦБ, 15,0; 2,4′-ЦБ, 1,0; 2,2′,4-ЦБ, 0,5; и 2,4,4′-ЦБ, 0,5. Клетки

LB400 ( ohb ) выращивали в жидкой среде K1 с повторными добавлениями 2 мМ 2-CBA до ОП 600 , равной 1,0. Истощение субстрата подтверждали с помощью ВЭЖХ. Общее количество использованного субстрата составляло 5 мМ.Затем выращенные на СВА клетки инокулировали в жидкую среду К1 с бифенилом в качестве единственного источника углерода. Контрольный штамм LB400 также выращивали на бифениле. Для измерения роста на ПХБ в каждую пробирку добавляли 1 мл исходной смеси М или раствора С и давали ацетону испариться. Затем добавляли десять миллилитров среды К1 и инокулировали пробирку. Общая концентрация ПХБ номинально составляла 5 мМ. Рост оценивали путем измерения оптической плотности культур при 600 нм с 24-часовыми интервалами.Исчезновение ПХБ контролировали с помощью газовой хроматографии (23).

Анализ CBA и HOPDA.

Хлорбензойные кислоты анализировали с помощью ВЭЖХ с использованием хроматографа Hewlett-Packard 1050, оснащенного обращенно-фазовой колонкой RP-18 (Alltech) с внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 250 мм. Водный растворитель содержал 1 мл 85% -орто--фосфорной кислоты и 600 мл метанола на литр. Скорость потока составляла 1,5 мл/мин. Детектор ВЭЖХ устанавливали на 230 нм. Продукты идентифицировали путем сравнения времени удерживания со временем удерживания аутентичных стандартов.Образование 2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-2,4-диеновых кислот (HOPDA) анализировали с помощью сканирования бесклеточного супернатанта в видимой области спектра (23).

Получение продуктов дехлорирования Ароклор 1242.

Осадок (91,1 % песка, 8,1 % ила и глины, 6,7 % органического вещества, 0,71 % общего азота, pH 7,2) собирали из реки Красный кедр (MI), сушили на воздухе и пропускали через сито с размером ячеек 4 мм. сито. Суспензии осадка в восстановленной анаэробной минеральной среде (34) добавляли до концентрации 70 мкг ПХБ на грамм сухого веса осадка с помощью Aroclor 1242 в небольшом объеме ацетона.Отложения речного изюма (MI) помещали в колбы Эрленмейера, предварительно промытые бескислородной газовой смесью азота и диоксида углерода (80:20). К осадкам добавляли равный объем стерильной восстановленной анаэробной минеральной среды, содержимое встряхивали в течение 2 мин и давали отстояться (31). Супернатант, содержащий элюированные микроорганизмы, дехлорирующие ПХБ, использовали для инокуляции загрязненного осадка реки Ред Кедр. Закрытые флаконы инкубировали в анаэробных условиях в темноте при комнатной температуре в течение 1 года.Осадок, содержащий смесь продуктов дехлорирования Aroclor 1242, затем высушивали на воздухе и использовали в анализах аэробного разложения ПХБ.

Микрокосмы аэробных отложений.

Природные устойчивые к рифампину варианты (35) рекомбинантов RHA1 ( fcb ) и LB400 ( ohb ) выращивали на среде, содержащей 3 мМ (номинальная концентрация) бифенила. Клетки однократно промывали средой К1, ресуспендировали, разводили в той же среде (23) и к 1 г осадка, содержащего продукты дехлорирования Ароклора 1242, добавляли 1 мл до плотности 10 4 (низкоплотная обработка ) или 10 6 (обработка с высокой плотностью) клеток г -1 осадка для каждого рекомбинантного штамма.В качестве контроля использовали незагрязненный осадок и незасеянный загрязненный осадок, помещенные в одинаковые условия. Колбы (20 мл) постоянно встряхивали при 150 об/мин и инкубировали в трех экземплярах при 30°С в течение 30 дней. Каждую колбу открывали один раз в неделю для обеспечения аэробных условий. Образцы отложений хранили при температуре -20°C для выделения ДНК и ПХБ. Для анализа ПХБ дубликаты образцов каждой обработки забивали через заранее определенные интервалы времени, экстрагировали и анализировали с помощью газовой хроматографии, как описано ранее (31).

Подсчет бактерий.

Перед инокуляцией трансформантов подсчитывали общее количество бактерий в микрокосмах аэробного осадка путем окрашивания 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеином (DTAF) с последующей эпифлуоресцентной микроскопией (5). Сразу после инокуляции и через 10, 15 и 30 дней инкубации трансформанты подсчитывали путем посева на селективную среду. Образцы, взятые для этой цели, немедленно разбавляли и соответствующие разведения наносили на агар Луриа-Бертани, содержащий рифампин (50 мкг/мл).КОЕ для обоих штаммов определяли через 1 неделю инкубации.

Экстракция ДНК и ПЦР-анализ в реальном времени.

Суммарную ДНК из осадка экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора для экстракции ДНК Ultraclean Soil (MoBio, Inc., Солана-Бич, Калифорния) и использовали для мониторинга обоих рекомбинантных штаммов с помощью ПЦР в реальном времени. Последовательности зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени были разработаны с использованием программного обеспечения Primer Express (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Зонд содержал 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) в качестве репортерного флуорохрома на 5′-конце и TAMRA ( N , N , N’ , N’- тетраметил-6-карбоксиродамин) в качестве гасителя на 5′-конце. 3′-конец последовательности нуклеотидов (таблица).ПЦР проводили в спектрофлуориметрическом термоциклере системы обнаружения последовательностей ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Ранее была построена стандартная кривая по изменениям сигнала флуоресцентного репортера (Δ R n ) в зависимости от номера цикла во время ПЦР, что позволило определить пороговый цикл ( C T ) (32).

Стабильность генов

fcb и ohb .

Каждый раз, когда определяли КОЕ рекомбинантных бактерий из микрокосмов осадка путем посева на агар Луриа-Бертани, содержащий рифампин (50 мкг/мл), доли колоний, содержащих fcb — и ohb-, определяли путем сбора 10 колоний каждого штамма и скрининг гена fcb или ohb с помощью ПЦР-амплификации.Матричную ДНК для ПЦР готовили путем лизиса целых клеток в 100 мкл 0,05 N NaOH при 95°C в течение 15 мин. Праймеры были специально разработаны для генов fcbB и ohb (таблица) для получения продуктов ПЦР размером 599 и 580 п.н. соответственно. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционных смесей, содержащих по 10 пмоль каждого праймера, 200 мкМ концентрации каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 400 нг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1× буфера Taq , 1,5 ЕД ДНК-полимеразы Taq ( Сигма, св.Louis, Миссури) и 2 мкл матрицы ДНК. ПЦР начинали с 3-минутной стадии денатурации при 94°С, затем следовали 30 циклов с температурой денатурации 94°С в течение 1 мин, отжигом праймеров при 55°С для fcbB и при 58°С для ohb для 30 с, и удлинение при 72°С в течение 2,1 мин, с заключительным удлинением на 5 мин. Аликвоты продуктов ПЦР объемом 3 мкл анализировали в 1% агарозных гелях.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование штамма LB400 (

ohb ) с расширенными метаболическими способностями.

Оперон ohb , кодирующий оксигенолитическое орто- дегалогенирование (38), был клонирован в вектор pRT1 с получением pRO41. Трансформация штамма LB400 путем электропорации с помощью pRO41 позволила клеткам расти на чашках с агаром LB, содержащим тетрациклин (10 мкг/мл). Трансформанты, теперь названные LB400 ( ohb ), реплицировали на чашках K1 с агаром и тетрациклином с 1 мМ 2-CBA в качестве единственного источника углерода. ПЦР-амплификация цельных клеток с использованием ohb -специфических праймеров подтвердила наличие целевых катаболических генов в трансформантах (данные не показаны).Штамм LB400 ( ohb ) рос в жидкой среде К1, содержащей 2-ХБК в качестве единственного источника углерода, и выделял стехиометрические количества хлорида. Полное исчезновение 2-ХБК подтверждали с помощью ВЭЖХ. Контроли штамма LB400, трансформированного плазмидой без генов ohb (pRT1), не росли в среде, содержащей 2-ХБК.

Пересеянные клетки LB400( ohb ) были морфологически (колония и клетка) и фенотипически очень похожи на родительский штамм LB400, сохраняя способность расти на бифениле, бензоате, 2-CB, 4-CB и 2,4- КБ.Ген 16S рРНК из LB400 ( ohb ) амплифицировали с помощью ПЦР и частично секвенировали, подтверждая идентичность рекомбинантного штамма (данные не показаны).

Рост на синтетических смесях ПХБ М и С.

Клетки штамма дикого типа LB400 и его рекомбинантного, LB400( ohb ), ранее выращенные на бифениле, разлагали 94% ПХБ в смеси С (рис. ). Рекомбинантный штамм LB400 ( ohb ) вырос до конечной OD 600 1,1 и не накапливал 2-CBA или 2,4-CBA, тогда как штамм LB400 дикого типа вырос до OD 600 . 0.74 и накапливали 3,27 мМ и 0,11 мМ 2- и 2,4-ХБК соответственно. Конечные концентрации 4-CBA были одинаковыми как для штаммов дикого типа (0,18 мМ), так и для трансформантных (0,13 мМ) штаммов, при этом ни в одном случае этот метаболит не использовался. Концентрации HOPDA были на 38% меньше для рекомбинантного штамма. Общая концентрация хлоридов составляла 4,1 мМ для LB400 ( ohb ) и 1,8 мМ для штамма дикого типа.

Разложение определенных смесей искусственных ПХБ M (A) и C (B) рекомбинантным B.xenovorans , штамм LB400 ( ohb ) (S1) и его дикий тип (S2). Столбцы, показанные для S3, соответствуют незасеянным контролям. Данные представляют собой средние значения из дублированных образцов.

Подобная деградация была получена для LB400 дикого типа (79%) и рекомбинантного LB400( ohb ) (75%), когда использовали номинальную концентрацию смеси ПХБ М 5 мМ (рис. ). Оба штамма росли на смеси М со значениями OD 600 1,0 и 0,88 для LB400( ohb ) и LB400 соответственно. Опять же, не было накопления 2-CBA для LB400 ( ohb ), тогда как штамм LB400 дикого типа накапливал 1.56 мМ 2-CBA. Общая концентрация хлоридов составляла 7,6 мМ для LB400 ( ohb ) и 4,6 мМ для штамма дикого типа. Эти результаты подтверждают, что LB400 ( ohb ) может более полно метаболизировать и расти на этих ПХБ.

Анаэробное дехлорирование ПХД.

За 1 год анаэробной инкубации микроорганизмы речного изюма удалили 32% хлора из Ароклора 1242, преимущественно из позиций мета . Полученный профиль конгенера был очень похож на профиль М, за исключением того, что 2,4,4′-CB не накапливался (рис.). В то время как не было никаких признаков того, что бифенильная часть разлагалась, общая концентрация ПХБ по весу (мкг/г осадка) уменьшилась на 14,2% в результате дехлорирования.

Распределение конгенера Ароклор 1242 и концентрация (мкг г -1 ) в загрязненных отложениях в нулевой момент времени (А) или после 1 года инкубации в анаэробных условиях (В) с последующей аэробной инкубацией в течение 30 дней с рекомбинантными штаммами RHA1( fcb ) и LB400( ohb ) на 10 6 клеток г -1 осадка (С) или 10 4 клеток г -1 (D).См. ссылку 31 для конгенеров ПХБ, представленных каждым пиком.

Популяционная динамика рекомбинантных штаммов RHA1(

fcb ) и LB400( ohb ).

Прямой подсчет бактерий в осадке перед инокуляцией составил в среднем 4,82 × 10 8 клеток г -1 осадка. При нашем пределе обнаружения 10 2 клеток г -1 почвы в среде, содержащей рифампин, не удалось выделить аборигенные осадочные бактерии (рис. ). Из-за их отличительных колоний на чашках мы смогли подсчитать как рекомбинантный Rhodococcus sp.штамм RHA1 ( fcb ) и рекомбинантный штамм B. xenovorans LB400 ( ohb ). Количество бактерий увеличивалось как при высокой (10 6 клеток на грамм осадка), так и при низкой (10 4 клеток на грамм осадка) плотности инокуляции, когда присутствовали ПХБ (рис. ). При обработке инокуляцией высокой плотности количество клеток RHA1 ( fcb ) увеличилось до 7,8 × 10 6 устойчивых к рифампину клеток г -1 осадка, в то время как количество клеток LB400 ( ohb ) увеличилось до 1.4 × 10 7 клеток г -1 осадок. Мы обнаружили примерно 3,8 × 10 6 и 6,2 × 10 6 клеток г -1 осадка для RHA1 ( fcb ) и LB400 ( ohb ) соответственно при обработке низкой плотностью на 15-й день. Колонии LB400( ohb ) не были обнаружены на агаризованной среде с незагрязненной обработкой, в то время как колонии RHA1( fcb ) увеличились с 1,0 × 10 4 до только 2,2 × 10 5 клеток г -1 почвы на 10-й день (рис.). Ни один из типов клеток не появился на чашках с не инокулированным контролем, содержащим ПХБ (рис. 1).

Плотность популяции рекомбинантных штаммов Rhodococcus sp. штамм RHA1( fcb ) (•) и штамм B.xenovorans LB400( ohb ) (▾), содержащие опероны fcb и ohb , соответственно, инокулированные в осадок, ранее загрязненный Ароклором 1242. подверглись анаэробному дехлорированию ПХБ. Количество клеток также оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan fcb (□) и TaqMan ohb (▵).(A) Плотность инокуляции 10 6 клеток г -1 осадка для каждого штамма. (B) Плотность инокуляции 10 4 клеток г -1 осадка для каждого штамма. (C) Незагрязненный контроль с плотностью посева 10 4 клеток г -1 осадка для каждого штамма. (D) Неинокулированный контроль. Значение выше каждого времени выборки представляет собой стабильность оперона fcb или ohb в 10 случайно выбранных колониях из каждого штамма, когда выделение было возможно выше предела обнаружения.Там, где планки погрешностей не показаны, стандартная ошибка троек была меньше размера символа.

Мониторинг RHA1 (

fcb ) и LB400 ( ohb ) с помощью ПЦР в реальном времени.

Мы использовали пороговое значение цикла ( C T ) 32 для отрицательной амплификации, основанное на предыдущем тестировании (не показано). Результаты ПЦР в реальном времени хорошо коррелировали с данными подсчета на чашках. Рассчитанные КОЕ г -1 осадка для RHA1 ( fcb ) и LB400 ( ohb ) с использованием зондов TaqMan fcb и ohb составили 4.5 × 10 6 и 4,4 × 10 7 клеток г -1 осадка соответственно на 15-й день для обработки с высокой плотностью инокуляции (рис. ). Для инокуляции с низкой плотностью расчетное количество КОЕ г -1 также увеличивалось для обоих рекомбинантных штаммов, достигая сходных значений на 15-й день для RHA1 ( fcb ) (5,3 × 10 6 ) и LB400 ( ohb). ) (4,4 × 10 6 ) (рис. ). Мы также обнаружили примерно 3,1 × 10 5 клеток g -1 RHA1 ( fcb ) в образцах, полученных из осадка, не содержащего ПХБ, тогда как рассчитанное количество клеток для LB400 ( ohb ) было ниже предела обнаружения после 10 день (рис.). Образцы отложений, взятые из контрольных образцов, не подвергшихся инокуляции, не показали увеличения флуоресценции выше порогового значения (рис. 1).

Стабильность оперонов

fcb и ohb .

Опероны fcb и ohb штаммов RHA1 ( fcb ) и LB400 ( ohb ) соответственно оказались стабильными в почве в отсутствие антибиотиков. На самом деле ПХД формально селективны. Все проверенные колонии, за исключением одной колонии LB400 ( ohb ), дали продукты ПЦР-амплификации (фиг.) ожидаемых размеров 599 п.н. и 580 п.н. из клеточных лизатов RHA1 ( fcb ) и LB400 ( ohb ) соответственно. Кроме того, те же изолированные колонии LB400( ohb ) и RHA1( fcb ), которые давали положительную амплификацию продуктов ПЦР, росли на твердых средах, содержащих 2-ХБК или 4-ХБК в качестве единственного источника углерода соответственно. Все колонии сохраняли способность расти на бифениле.

Разложение дехлорированного Ароклора 1242 было эффективным как при обработке инокуляцией с низкой, так и с высокой плотностью (рис.), хотя, как и ожидалось, он был немного быстрее с инокулятом высокой плотности. Однако через 30 дней степень удаления ПХБ при высокой и низкой плотности инокуляции составила 57% и 54% соответственно. Только небольшое количество ПХБ (4%) разлагалось при неинокулированной обработке, что указывает на то, что инокулированные рекомбинантные штаммы ответственны за деградацию анаэробных продуктов дехлорирования Aroclor 1242. Основными неразложившимися конгенерами были 2,2′-/2,6-, 2,4′-, 2,4,2′-, 2,6,2′-, 2,6,4′- и 2, 4,2′,4′-хлорбифенил (рис.). Конечные концентрации ПХБ составили 24,4 и 26,8 мкг на г осадка для инокулята высокой и низкой плотности соответственно.

Процентное содержание ПХБ, оставшихся во время аэробной обработки рекомбинантными штаммами RHA1 ( fcb ) и LB400 ( ohb ) после инкубации с двумя различными плотностями инокулята. Обозначения: •, 10 6 клеток каждого штамма г -1 осадка; ▾, 10 4 клеток каждого штамма г -1 осадка; ▪, незасеянный контроль.Дублирующие образцы использовали для контроля без инокуляции. Там, где планки погрешностей не показаны, стандартная ошибка троек была меньше размера символа.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы показали, что рекомбинантный штамм RHA1 ( fcb ) может расти в свежезагрязненной почве одним конгенером ПХБ, 4-CB, и что рост коррелирует с исчезновением этого загрязнителя (33). Здесь отложения, загрязненные Aroclor 1242, инкубировались с консорциумами из осадка, дехлорирующего ПХБ, в течение 1 года, а продукты дехлорирования ПХД использовались в качестве субстратов для аэробной фазы разложения ПХБ с использованием RHA1 ( fcb ) плюс вновь сконструированный штамм. с различной специфичностью конгенеров ПХД.

Ранее мы использовали альтернативный подход к конструированию бактерий, разлагающих ПХБ, путем создания пути in vitro с введением специфических генов деградации хлорбензоата и направлением ПХБ в субстраты для уже существующих центральных путей метаболизма для штамма VP44 Comamonas testosteroni (27) и Rhodococcus sp. штамм RHA1 (32, 33). Для этого исследования мы использовали тот же подход, но заменили его хорошо известным разлагающим ПХБ B.xenovorans штамм LB400 для штамма VP44 из-за предпочтительной атаки LB400 на орто--замещенных колец (23), которые являются наиболее заметными и проблематичными продуктами анаэробного дехлорирования ПХБ (3). Клонирование генов оксигенолитического орто--дегалогенирования ( ohb ) в LB400 было возможно с помощью того же грамположительного/грамотрицательного челночного вектора pRT1, который использовался для RHA1 ( fcb ), что свидетельствует о его полезности для конструирования деструкторов ПХБ разных родов. .Способность нового рекомбинантного штамма LB400 ( ohb ) расти на 2 мМ 2-CBA со 100% высвобождением хлорида указывает на экспрессию оперона ohb . Кроме того, во время роста LB400 ( ohb ) на 5 мМ смеси ПХБ М и С наблюдалась конкатенированная экспрессия путей bph (бифенил) и ohb без накопления 2-CBA. Эффективность использования этих смесей была одинаковой как для исходного LB400, так и для его рекомбинантного LB400( ohb ) (рис.), причем последние демонстрируют лучший рост наряду с полной минерализацией 2-CBA.

При оценке пригодности LB400 ( ohb ) для использования в процессе анаэробной/аэробной биологической очистки мы сравнили его способность разлагать смеси ПХБ M и C. Профили ПХБ Pattern M являются результатом микробно-опосредованного дехлорирования Aroclor 1242 и других менее хлорированные коммерческие смеси ПХБ из позиций мета . Таким образом, паттерн М представляет собой смесь преимущественно орто- и пара--замещенных конгенеров.Он стойкий, по-видимому, опосредован спорообразующим микроорганизмом (40), и широко распространен в окружающей среде. Процесс Q удаляет хлор из пара- положений, а образец С, состоящий в основном из орто--замещенных конгенеров, получается в результате совместного действия процессов М и Q (3). Дехлорирование ароклоров из положения орто происходит крайне редко, и нет четких доказательств того, что это произошло в природе. Таким образом, смеси конгенеров ПХД, приближающиеся к схемам M и C, подходят для тестирования способности микроорганизмов к аэробному биоразложению для использования в процессах анаэробной/аэробной биологической очистки: M полезен, потому что его легче достижимо, а C представляет собой максимально достижимую смесь дехлорирования. .

LB400 ( ohb ) разложил 94% ПХБ в смеси C и 75% ПХБ в смеси M. Таким образом, есть преимущество в достижении более интенсивного дехлорирования ПХБ на анаэробной стадии процесса анаэробной/аэробной биоочистки. для печатных плат. Тем не менее, из-за широкого диапазона субстратов можно ожидать, что LB400 ( ohb ) будет вызывать существенное снижение концентрации ПХБ во время аэробной фазы, даже когда анаэробное дехлорирование ограничено положениями мета .

Двухэтапная анаэробно-аэробная биоремедиационная обработка ПХД была затем испытана в речных отложениях, загрязненных Ароклором 1242, с использованием недавно сконструированного штамма B. xenovorans LB400 ( ohb ) с его способностью к дехлорированию орто- и Родококк зр. штамм RHA1 ( fcb ) с его дехлорирующей способностью para . Во-первых, мы подтвердили, что анаэробный процесс имел место с ожидаемыми сдвигами в паттернах различных конгенеров (рис.), без потери общего молярного содержания ПХБ, но со значительным снижением общего веса ПХД (14,2%) благодаря удалению хлора (30, 31). Во-вторых, оба рекомбинантных штамма выросли примерно до 10 6 КОЕ на грамм осадка через 15 дней (рис. ), хотя клетки RHA1 ( fcb ) выросли на 1 порядок в незагрязненных образцах микрокосма (рис. ), предполагая, что в то время как этот штамм мог расти на субстратах, уже присутствующих в отложениях, он рос лучше, когда его уникальные субстраты, т.е.э., присутствовали продукты дехлорирования ПХБ. Штамм LB400 ( ohb ) рос еще более интенсивно в тех же условиях, что согласуется с его способностью расти на некоторых из орто--хлорированных ПХБ, наиболее распространенных продуктов анаэробного дехлорирования Ароклора 1242.

ПЦР в реальном времени данные подтвердили тот же характер роста популяции, наблюдаемый при подсчете чашек (рис. ). Разница между подсчетом чашек и предполагаемым количеством клеток RHA1 ( fcb ) с помощью ПЦР в реальном времени была <1 порядка, что подтверждает надежность обоих методов.Кроме того, другие исследования этих образцов с использованием ДНК-микрочипов, содержащих зонды для генов ароматических оксигеназ, присутствующих в путях bph , fcb и ohb , дали сходные количественные результаты (8). Согласованность данных для всех трех методов плюс ожидаемое потребление субстратов свидетельствует о том, что рекомбинантные штаммы успешно росли при добавлении к естественному местному сообществу.

Поскольку инокуляция является дорогостоящим компонентом технологии биоремедиации, мы протестировали умеренную и низкую плотность инокуляции.Ксенобиотическая деградация и выживание штаммов в почве обычно изучались при плотности инокуляции, намного превышающей способность почвы нести эти штаммы. Неизбежно в таких случаях количество клеток уменьшается на 4–6 порядков за небольшой промежуток времени (14, 18, 22, 36). Этого не было в наших экспериментах, поскольку мы инокулировали образцы при относительно низкой плотности клеток и смогли увидеть увеличение количества клеток (рис. 1). Наши результаты, особенно при целевом количестве инокулята 10 4 клеток на грамм почвы, показывают, что такая же скорость и степень биодеградации могут быть достигнуты при разумных затратах на масштабирование.

Таким образом, основное преимущество штаммов, культивирующих ПХБ, заключается в том, что необходимо поддерживать адекватную популяцию, разлагающую ПХД, и это позволит избежать либо повторной инокуляции штаммов на загрязненном участке (12), либо использования второго источника углерода для стимулируют сопутствующий метаболизм, такие как бифенил (2, 13), поверхностно-активные вещества (20, 21) или ароматические соединения растений (11). Однако для того, чтобы этот подход был успешным, плазмидные конструкции должны оставаться стабильными, что имело место в ходе нашего эксперимента (рис.). Хотя бактерии, разлагающие бифенил, можно легко найти в почве, разрушители хлорбензоата с необходимой специфичностью к субстрату встречаются относительно редко (10), а активность инокулированных разрушителей хлорбензоата во время разложения ПХД приводит к более высокой скорости минерализации в экспериментах с жидкостью и почвой (14, 15). ), предоставляя дополнительные доказательства пользы от сконструированных штаммов.

ССЫЛКИ

1. Adams, R.H., C.-H. Хуанг, Ф. К. Хигсон, В. Бреннер и Д. Д. Фохт. 1992 г.Конструирование рекомбинанта, использующего 3-хлорбифенил, из межродового скрещивания. заявл. Окружающая среда. микробиол. 58 : 647-654. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]2. Баррио Д. и М. Сильвестр. 1993. Факторы, влияющие на деградацию ПХБ имплантированным бактериальным штаммом в микрокосмах почвы. Могу. Дж. Микробиол. 39 : 594-602. [PubMed] [Google Scholar]

3. Bedard, DL, and JF Quensen III. 1995. Микробное восстановительное дехлорирование полихлорированных дифенилов, с.127-216. В Л.Ю. Янг и К.Э. Чернилья (ред.), Микробная трансформация и разложение токсичных органических химических веществ. Wiley-Liss, New York, NY

4. Bergmann, JG, and J. Sanik, Jr. 1957. Определение следовых количеств хлора в лигроине. Анальный. хим. 29 : 241-243. [Google Scholar]

5. Bloem, J. 1995. Флуоресцентное окрашивание микробов для общего прямого подсчета, 4.1.8.1–4.1.8.12. В А. Д. Л. Аккерманс, Дж. Д. В. Эльзас и Ф.JD Bruijn (ed.), Руководство по молекулярной микробной экологии, 2-е изд. Клувер, Дордрехт, Нидерланды.

6. Bopp, L.H. 1986. Разложение сильно хлорированных ПХД штаммом Pseudomonas LB400. J. Ind. Microbiol. 1 : 23-29. [Google Академия]7. Браун, Дж. Ф. младший, Р. Э. Вагнер, Д. Л. Бедард, М. Дж. Бреннан, Дж. К. Карнахан, Р. Дж. Мэй и Т. Дж. Тоффлемайр. 1984. Трансформация ПХБ в отложениях верхнего Гудзона. К северо-востоку. Окружающая среда. науч. 3 : 167-179.[Google Академия]8. Денеф, В. Дж., Дж. Парк, Дж. Л. М. Родригес, Т. В. Цой, С. А. Хашшам и Дж. М. Тиедже. 2003. Валидация более чувствительного метода использования пятнистых олигонуклеотидных ДНК-микрочипов для функциональных геномных исследований бактериальных сообществ. Окружающая среда. микробиол. 5 : 933-943. [PubMed] [Google Scholar]9. Фиш, К. М. и Дж. М. Принцип. 1994. Биотрансформация Ароклора 1242 в микрокосмах пробирки реки Гудзон. заявл. Окружающая среда. микробиол. 60 : 4289-4296.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]10. Focht, DD 1995. Стратегии улучшения аэробного метаболизма полихлорированных дифенилов. Курс. мнение Биотехнолог. 6 : 341-346. [Google Академия] 11. Гилберт, Э. С., и Дэвид Э. Кроули. 1997. Растительные соединения, вызывающие биодеградацию полихлорбифенила под действием Arthrobacter sp. штамм B1B. заявл. Окружающая среда. микробиол. 63 : 1933-1938. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]12. Гольдштейн, Р. М., Л. М. Мэллори и М. Александр. 1985. Причины возможной неудачи инокуляции для усиления биодеградации. заявл. Окружающая среда. микробиол. 50 : 977-983. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]13. Харкнесс, М. Р., Дж. Б. Макдермотт, Д. А. Абрамович, Дж. Дж. Сальво, В. П. Фланаган, М. Л. Стивенс, Ф. Дж. Монделло, Р. Дж. Мэй, Дж. Х. Лобос и К. М. Кэрролл. 1993. In situ стимуляция аэробного биоразложения ПХБ в отложениях реки Гудзон. Наука 259 : 503-507.[PubMed] [Google Scholar] 14. Гавел, Дж. и В. Райнеке. 1993. Разложение Ароклора 1221 в почве гибридной псевдомонадой. ФЭМС микробиол. лат. 108 : 211-218. [PubMed] [Google Scholar] 15. Hickey, W.J., D.B. Searles, and D.D. Focht. 1993. Повышенная минерализация полихлорированных бифенилов в почве, инокулированной бактериями, разлагающими хлорбензоат. заявл. Окружающая среда. микробиол. 59 : 1194-1200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

16. Holoubek, I. 2001. Места, загрязненные полихлордифенилом (ПХБ) по всему миру, с. 17-26. В Л. В. Робертсон и Л. Г. Хансен (ред.), ПХБ, последние достижения в области токсикологии окружающей среды и воздействия на здоровье. The University Press of Kentucky, Lexington, Ky.

17. Hrywna, Y., T.V. Tsoi, O.V. Maltseva, J.F. Quensen, and J.M. Tiedje. 1999. Конструирование и характеристика двух рекомбинантных бактерий, которые растут на орто-— и пара--замещенных хлорбифенилах.заявл. Окружающая среда. микробиол. 65 : 2163-2169. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]18. Huertas, M.-J., E. Duque, S. Marques и JL Ramos. 1998. Выживание в почве различных штаммов Pseudomonas , разлагающих толуол, после воздействия растворителя. заявл. Окружающая среда. микробиол. 64 : 38-42. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

19. Hutzinger, O., and W. Veerkamp. 1981. Ксенобиотические химические вещества с потенциалом загрязнения, с. 3-45. В Т.Лейзингер, Р. Хаттер, А. М. Кук и Дж. Нуеш (ред.), Микробная деградация ксенобиотиков и стойких соединений. Academic Press, Inc., New York, NY

20. Lajoie, C.A., G.J. Zylstra, M.F. DeFlaun, and P.F. Strom. 1993. Разработка векторов полевого применения для биоремедиации почв, загрязненных полихлорбифенилами. заявл. Окружающая среда. микробиол. 59 : 1735-1741. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]21. Лажуа, К. А., А. К. Лейтон и Г.С. Сайлер. 1994. Кометаболическое окисление полихлорированных дифенилов в почве при полевом применении на основе ПАВ. заявл. Окружающая среда. микробиол. 60 : 2826-2833. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]22. Леунг, К. Т., А. Ватт, Х. Ли и Дж. К. Трэворс. 1997. Количественное определение разлагающих пентахлорфенол Sphingomonas sp. UG30 в почве по протоколу наиболее вероятного числа/полимеразной цепной реакции. Дж. Микробиол. Методы 31 : 59-66.[Google Академия] 23. Мальцева О.В., Цой Т.В., Квенсен Дж.Ф. III, Фукуда М., Тиедже Дж.М. 1999. Разложение продуктов анаэробного восстановительного дехлорирования Арохлора 1242 четырьмя аэробными бактериями. Биодеградация 10 : 363-371. [PubMed] [Google Scholar] 24. Масаи Э., А. Ямада, Дж. М. Хили, Т. Хатта, К. Кимбара, М. Фукуда и К. Яно. 1995. Характеристика генов катаболизма бифенила грамположительного разрушителя полихлорированного бифенила Rhodococcus sp.штамм RHA1. заявл. Окружающая среда. микробиол. 61 : 2079-2085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]25. Мастер, Э. Р., В. В.-М. Лай, Б. Кейперс, В. Р. Каллен и В. В. Мон. 2002. Последовательная анаэробно-аэробная обработка почвы, загрязненной выветрившимся Ароклором 1260. Окружающая среда. науч. Технол. 36 : 100-103. [PubMed] [Google Scholar] 26. McCullar, M.V., V. Brenner, R.H. Adams, and D.D. Focht. 1994. Создание новой бактерии, разлагающей полихлорированные бифенилы: использование 3,4′-дихлорбифенила Pseudomonas acidovorans M3GY.заявл. Окружающая среда. микробиол. 60 : 3833-3839. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]27. Мокросс Х., Э. Шмидт и В. Рейнеке. 1990. Разложение 3-хлорбифенила гибридными псевдомонадами, сконструированными in vivo. ФЭМС микробиол. лат. 71 : 179-186. [PubMed] [Google Scholar] 28. Mondello, FJ 1989. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli из Pseudomonas штамма LB400 генов, кодирующих деградацию полихлорированного бифенила.Дж. Бактериол. 171 : 1725-1732. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]29. Potrawfke, T., TH Lohnert, K.N. Timmis, and R.M. Wittich. 1998. Минерализация низкохлорированных бифенилов Burkholderia sp. штамм LB400 и двухчленным консорциумом при направленном межвидовом переносе генов хлоркатехинового пути. заявл. микробиол. Биотехнолог. 50 : 440-446. [Google Академия] 30. Квенсен, Дж. Ф., III, Дж. М. Тидже и С. А. Бойд. 1988.Восстановительное дехлорирование полихлорбифенилов анаэробными микроорганизмами из осадков. Наука 242 : 752-754. [PubMed] [Google Scholar] 31. Quensen, JF, III, S.A. Boyd, and JM Tiedje. 1990. Дехлорирование четырех коммерческих смесей полихлорированных бифенилов (Ароклорс) анаэробными микроорганизмами из донных отложений. заявл. Окружающая среда. микробиол. 56 : 2360-2369. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]32. Родригес, Дж. Л. М., М. Р. Айелло, Дж.Урбанс, Т. В. Цой и Дж. М. Тидже. 2002. Использование как 16S рРНК, так и сконструированных функциональных генов с ПЦР в реальном времени для количественного определения сконструированного, разлагающего ПХД Rhodococcus в почве. Дж. Микробиол. Методы 51 : 181-189. [PubMed] [Google Scholar] 33. Родригес, Дж. Л. М., Мальцева О. В., Цой Т. В., Хелтон Р. Р., Квенсен Дж. Ф., Фукуда М., Тиедже Дж. М. 2001. Разработка рекомбинантного штамма Rhodococcus для деградации продуктов анаэробного дехлорирования Ароклора 1242.Окружающая среда. науч. Технол. 35 : 663-668. [PubMed] [Google Scholar] 34. Шелтон, Д. Р. и Дж. М. Тидже. 1984. Общий метод определения потенциала анаэробного биоразложения. заявл. Окружающая среда. микробиол. 47 : 850-857. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]35. Смит, М.С. и Дж.М. Тидже. 1980. Рост и выживание устойчивых к антибиотикам штаммов денитрификаторов в почве. Могу. Дж. Микробиол. 26 : 854-856. [Google Академия] 36. Челет, Р., Р. Мекенсток, П. Стейнле и Дж. Р. ван дер Меер. 1999. Динамика численности интродуцированной бактерии, разлагающей хлорированные бензолы, в толще почвы и в осадке сточных вод. Биодеградация 10 : 113-125. [PubMed] [Google Scholar]

37. Тиедже, Дж. М., Т. В. Цой, К. Д. Пеннел, Л. Д. Хансен, А. Вани, Дж. Л. М. Родригес, Ю. Хрюна и Д. П. Хауэлл. 2005. Улучшение биоремедиации ПХБ, с. 147-214. В Дж. В. Тэлли (ред.), Биоремедиация стойких соединений.CRC Press, Boca Raton, Fla.

38. Tsoi, T.V., E.G. Plotnikova, J.R. Cole, W.F. Guerin, M. Bagdasarian, and J.M. Tiedje. 1999. Клонирование, экспрессия и нуклеотидная последовательность генов Pseudomonas aeruginosa 142 ohb , кодирующих оксигенолитическое орто- дегалогенирование галогенбензоатов. заявл. Окружающая среда. микробиол. 65 : 2151-2162. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

39. Unterman, R. 1996. История деградации ПХД, с.209-253. В Р. Л. Кроуфорд и Д. Л. Кроуфорд (ред.), Принципы и применение биоремедиации. Издательство Кембриджского университета, Кембридж, Соединенное Королевство.

40. Ye, D., J.F. Quensen III, J.M. Tiedje, and S.A. Boyd. 1992. Анаэробное дехлорирование полихлорбифенилов (Ароклор 1242) пастеризованными и обработанными этанолом микроорганизмами из осадков. заявл. Окружающая среда. микробиол. 58 : 1110-1114. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]41. Зайцев Г.М., Цой Т.В., Гришенков В.Г., Плотникова Е.Г., Боронин А.М. 1991. Генетический контроль разложения хлорированных бензойных кислот в штаммах Arthrobacter globiformis , Corynebacterium sepedonicum и Pseudomonas cepacia . ФЭМС микробиол. лат. 81 : 171-176. [PubMed] [Google Scholar]42. Zwiernik, MJ, JF Quensen III и S.A. Boyd. 1998. FeSO 4 поправки стимулируют экстенсивное анаэробное дехлорирование ПХБ.Окружающая среда. науч. Технол. 32 : 3360-3365. [Google Scholar]

Мальцева Фамилия

Чтобы узнать больше о фамилии Мальцева , нужно узнать больше о людях, которые, вероятно, имеют общее происхождение и предков. Это одно из аргументированных объяснений, почему нормально, что фамилия Мальцева больше представлена ​​в одной или нескольких странах мира, чем в других. Прямо здесь вы узнаете, в каких народах мира намного больше людей с фамилией Мальцева .

Фамилия

Мальцева в земной шар

Глобализация привела к тому, что фамилии распространяются далеко за пределы страны их происхождения, так что можно получить африканские фамилии в Европе или индийские фамилии в Океании. То же самое происходит и с Мальцевой , что, как вы можете подтвердить, можно констатировать, что это фамилия, которую можно встретить во многих странах земного шара. Точно так же можно найти народы, у которых точно плотность мужчин и женщин из-за фамилии Мальцева более чем далеко.

Карта

Мальцева фамилия

Вероятность изучения на карте мира того, какие народы Мальцева на планете владеют большим количеством, нам очень помогает. Поместив себя на карту для материальной нации, мы могли бы начать видеть конкретное количество людей, которым помогает фамилия Мальцева , чтобы таким образом получить конкретную информацию обо всех Мальцева , которые вы могли в настоящее время найти. в той нации.Все это также помогает нам узнать не только, откуда происходит фамилия Мальцева , но и каким образом переселялись и передвигались люди, изначально являющиеся элементом рода, носящего фамилию Мальцева . Таким же образом можно увидеть, по каким местам они поселились и выросли, вот почему, если Мальцева наша фамилия, то интересно, с какими другими странами, связанными с миром, возможно, что один из наших предков когда-то переехал в.

Наций с дополнительными

Maltseva на планете
  1. Россия (75952)
  2. Украина (7275)
  3. Узбекистан (2571)
  4. Казахстан (1844)
  5. Беларусь (1268)
  6. Туркменистан (626)
  7. Таджикистан (616)
  8. Кыргызстан (419)
  9. США (113)
  10. Эстония (54)
  11. Молдова (41)
  12. Испания (39)
  13. Приднестровье (32)
  14. (0373) Канада (0373)
  15. Азербайджан (13)
  16. Англия (11)
  17. Финляндия (9)
  18. Болгария (8)
  19. Абхазия (8)
  20. Германия (7)
  21. Австралия (7)
  22. Греция (5)
  23. 4
  24. 4 )
  25. Норвегия (5)
  26. Швейцария (4)
  27. Швеция (3)
  28. Франция (3)
  29. Армения (3)
  30. Турция (2)
  31. Чехия (2) (
  32. 9210333 Грузия)
  33. Израиль (2)
  34. Ливан (2)
  35. Аргентина (2) 9 1034
  36. Бельгия (2)
  37. Таиланд (1)
  38. Кипр (1)
  39. Шотландия (1)
  40. Ирландия (1)
  41. Иордания (1)
  42. Япония (1)
  43. Объединенные Арабские Эмираты (1)
  44. Мальта (1)
  45. Мексика (1)
  46. Австрия (1)
  47. Новая Зеландия (1)
  48. Пакистан (1)
  49. Если внимательно присмотреться, то апеллидос.de мы даем вам все необходимое для того, чтобы иметь достоверную информацию о том, какие страны на самом деле имеют наибольшее количество людей, использующих фамилию Мальцева на всем земном шаре. Более того, вы можете увидеть их очень наглядно на нашей карте, где страны, в которых проживает наибольшее количество лиц, которым помогает фамилия Мальцева , окрашены в более сильный тон. Таким образом, с одного взгляда, вы можете легко определить, у каких народов Мальцева является распространенной фамилией, а у каких народов Мальцева может быть редкой или несуществующей фамилией.

Валидация различных моделей ионосферы в высокоширотной зоне

При использовании моделей ионосферы большое значение придается их проверке. Наиболее распространенная Международная эталонная модель ионосферы постоянно тестируется в глобальном масштабе, но особое внимание привлекает зона высоких широт. В последние годы была предложена Эмпирическая канадская модель высокоарктической ионосферы (E-CHAIM), ориентированная на высокие широты и имеющая определенные преимущества. В данной работе обе модели тестируются по данным российского ионозонда Горьковская (60.27° с.ш., 29,38° в.д.), Ловозеро (67,97° с.ш., 35,02° в.д.), Норильск (69,4° с.ш., 88,1° в.д.) в дополнение к предыдущим результатам авторов. Период исследований для станций Горьковская и Ловозеро увеличен до одного года в условиях низкой солнечной активности (май 2017 г. — октябрь 2018 г.). Для станции Горьковская средние абсолютные отклонения |ΔfoF2| критической частоты для всех месяцев составила 0,33 МГц для модели E-CHAIM и 0,27 МГц для модели IRI. Это соответствует относительным ошибкам 11,56% и 9.51%. Для станции Ловозеро абсолютные отклонения составили 0,34 МГц для модели E-CHAIM и 0,31 МГц для модели IRI. Соответствующие относительные ошибки составили 11,8% и 11%. Сравнение по максимальной высоте hmF2 было проведено для трех вариантов модели IRI (AMTB2013, SHU2015, BSE1979) и модели E-CHAIM с экспериментальными данными. Для станции Норильск и условий солнечной активности почти полного цикла варианты АМТБ2013 и ШУ2015 нигде не имели преимуществ перед вариантами BSE1979 и Е-ЧАИМ.Летом абсолютные отклонения для всех моделей лежали в диапазоне 5–20 км, что приводило к стандартному отклонению, не превышающему 20 %. Зимой абсолютные отклонения могут достигать 50–70 км, однако, за исключением одного случая, стандартное отклонение не превышало 20 %. Для возмущенных условий результаты определения foF2 по модели E-CHAIM сравнивались с подходом, включающим использование полного электронного содержания TEC вместе с эквивалентной толщиной слоя ионосферы. Оказалось, что оба подхода хорошо воспроизводят усиление ночной ионизации, связанное со всплесками индекса АЭ.Модель E-CHAIM может завышать значения foF2, однако при положительных возмущениях оба подхода занижают значения foF2. Использование TEC может иметь определенное преимущество перед моделью E-CHAIM, поскольку TEC более объективно оценивает конкретные условия.

Елизавета Мальцева

Бег по грузу Елизавета Мальцева
  • 2021
  • 2020
  • 2019
  • 2018
  • 2017
  • 2016
  • 2015
  • 2012
  • 2011
  • 2010
  • О
  • Контакт
  • Инстаграм
  • Обратный рейс
  • ПИТАНИЕ С ХУДОЖНИКОМ подкаст
  • Галерея Рокби

2017 Неловкая еда

Невероятное фигуративное экспрессионистское искусство Евгении Мальцевой

Россия – большая страна, в которой много талантливых людей, создающих поистине удивительное искусство, разнообразное и интересное.Русские художники особенно известны своей свободой выражения и свободой творческой мысли, что приводит к впечатляющему диапазону работ во всех возможных стилях и средствах. Например, позвольте представить Евгению Мальцеву, одну из лучших современных российских художниц, чье сказочное фигуративное экспрессионистское искусство просто сногсшибательно.

Мальцева Евгения

Евгения Мальцева родилась в 1983 году в Ижевске, Россия. С детства увлекалась искусством.После окончания художественно-дизайнерского факультета Удмуртского государственного университета в Ижевске в 2005 году поступила в Российскую художественную академию в Казани, а через четыре года – в Школу свободных мастерских современного искусства при Московском музее современного искусства. Мальцева также была выбрана для учебы в Художественной академии в Лондоне.

Сегодня Евгения Мальцева — известная художница, известная своим фигуративным экспрессионистским искусством, отражающим ее внутренний мир, эмоции и чувства. Также Мальцева любит экспериментировать с другими стилями, смешивая их для создания чего-то нового и уникального.Ее великолепные картины, графика, скульптура и изделия из дерева экспонировались по всей России, а также на различных выставках в Великобритании, Германии, Монако, Китае, Индии и Нидерландах. Кроме того, работы Мальцевой находятся во многих частных и государственных коллекциях, в том числе в Музее современного искусства в Москве, Удмуртском республиканском музее изобразительных искусств в Ижевске и Российском центре науки и культуры в Тируванантапураме, Индия.

Если вы любите фигуративное экспрессионистское искусство, Fine Art Shippers настоятельно рекомендует обратить внимание на работы Евгении Мальцевой.Мы рады поделиться с вами некоторыми из ее удивительных творений из серий «Песнь песней», «Бруталити», «Мужественность» и «Упс-Пупси».

Спустя 100 лет королевская свадьба в России напоминает о царских днях

ST. САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, Россия — Под присмотром церемониального почетного караула невеста медленно шла по проходу, а стая молодых сопровождающих держала ее 23-футовый шлейф в воздухе.Жених, одетый в черные фалды, выжидательно стоял под золотым куполом Исаакиевского собора, а его мать наблюдала за происходящим из тронообразной мраморной ограды.

«Романовы возвращаются», — объявило в пятницу консервативное российское новостное издание, и с обручальными кольцами Фаберже, тиарой французского ювелира Chaumet и имперским орлом, вышитым на фате, казалось, что они вернулись в стиль.

Спустя более века после того, как последний царь и царица были убиты в результате большевистской революции, собрание знатных семей Европы собралось, чтобы отпраздновать первую королевскую свадьбу в России со времен имперской монархии.Женихом был великий князь Георгий Михайлович Романов, 40 лет, потомок российского императорского престола, а его итальянской партнершей была Ребекка Беттарини, 39 лет. благослови союз.

Романовы не имеют официального юридического статуса в России с момента свержения династии в 1917 году и не стремятся вернуться на престол. Но свадьба представляет собой кульминацию их попыток вновь утвердиться в общественной жизни страны после падения коммунизма 30 лет назад и, возможно, вернуть России ощущение имперской славы.

«Это чрезвычайно важное историческое событие для одной из самых влиятельных династий в мире», — сказал Рассел Мартин, профессор истории Вестминстерского колледжа в Пенсильвании, с преувеличением, которое казалось уместным для случая, облаченного в роскошь. Г-н Мартин, написавший книгу о свадебных традициях Романовых, является добровольным советником семьи, который помог обеспечить соответствие церемонии королевским традициям.

Среди королевских гостей были принцесса Бельгии Леа, королева Испании София, принц Рудольф и принцесса Тильсим из Лихтенштейна, а также последний царь Болгарии Симеон II.

Жених, которому 40 лет, сказал, что свадьба была частью цепочки маловероятных событий, которые его семья не могла предвидеть, когда он родился в 1981 году в Мадриде. Он правнук двоюродного брата последнего российского императора Николая II, великого князя Кирилла Владимировича Романова.

«Ни один член семьи Романовых никогда не думал, что мы вернемся сюда», — сказал он в интервью накануне свадьбы.

Выросший в Испании и Франции, г-н Романов получил образование в Оксфорде и работал в нескольких учреждениях Европейского Союза, а также в группе российского горнодобывающего гиганта «Норильский никель», прежде чем открыть собственное консалтинговое агентство.Согласно его официальной биографии, он связан с каждой королевской семьей в Европе.

Он и г-жа Беттарини, ныне Романовна, начали встречаться, когда жили в Брюсселе, но два года назад пара переехала в Москву, чтобы управлять благотворительным фондом, который они создали вместе в 2013 году. Г-жа Беттарини, которая также основала консалтинговую компанию, сказала в интервью, что она написала два романа во время пандемии Covid-19, в том числе один под названием «Аристократия».

Г-н Романов впервые приехал в Россию в 11-летнем возрасте на похороны своего деда, Великого Князя Владимира Кирилловича Романова, в 1992 году.Случайно родившийся в Финляндии, Владимир и его семья избежали участи, постигшей царя Николая II, его жену Александру, их детей и родственников: казни в 1918 году от рук большевиков, захвативших Россию.

Пятничная свадьба олицетворяет, по крайней мере частично, эволюционирующую память о Российской империи и семье, правившей ею на протяжении 300 лет. При коммунизме Романовых часто изображали отсталыми и ответственными за семейный и общественный коллапс.Но с 1990-х годов наследие семьи было передано могущественной Русской православной церкви, которая в 2000 году канонизировала Николая II, Александру и их пятерых детей.

церковь», — сказал Андрей Золотов, российский журналист, освещающий Православную церковь на протяжении трех десятилетий.

В 2008 году, спустя 90 лет после казни, Романовы были юридически «реабилитированы» или признаны жертвами «необоснованных репрессий», а не врагами государства.

Союз пары благословили высшее должностное лицо Русской православной церкви в Санкт-Петербурге митрополит Варсонофий и мать Романова, великая княгиня Мария Владимировна. В то время как руководство церкви признает притязания великой княгини на престол, есть и другие Романовы, которые это оспаривают. Невеста приняла православие и взяла имя Виктория Романовна. Она не дворянской крови, и свекровь решила ограничить ее доступ к королевским титулам.

Во время церемонии, согласно русской православной традиции, друзья и родственники жениха и невесты по очереди держали венцы над головами.

Несмотря на величие, трехдневная свадебная феерия содержала противоречивые элементы. Среди мужчин в кружке г-на Романова был Константин Малофеев, консервативный бизнесмен, который был ярым сторонником возвращения к монархии с тех пор, как в подростковом возрасте влюбился во «Властелина колец». Будучи студентом юридического факультета, он написал диссертацию о юридических способах восстановления российской королевской власти.

Но г-н Малофеев был под контролем США и ЕС. санкции с 2014 года за якобы финансирование пророссийских сепаратистов, воюющих на Украине.

В интервью он сказал, что в восторге от того, что свадьба пары представляет для консерваторов.

«Эта свадьба — восстановление традиции», — сказал он, добавив, что бракосочетание и возрождение Романовых не следует рассматривать через призму политики.

«Речь не идет о текущих политических событиях. Это наследие Европы. Семьи, присутствующие здесь, построили Европу такой, какой мы ее знаем».

Считается, что г-н Малофеев имеет хорошие связи в Кремле, как и Евгений В.Пригожин, владелец предприятия общественного питания, которое обеспечивало питанием некоторые свадебные мероприятия. Прокуратура США предъявила г-ну Пригожину обвинение в предполагаемых связях с фабрикой троллей, которая, по словам следователей, возглавляла усилия России по вмешательству в выборы в США в 2016 году. В этом году он был добавлен в «список разыскиваемых ФБР».

Несмотря на связи с официальными лицами, связанными с Кремлем, и молчаливое согласие правительства на ограниченное присутствие монарха, реакция Москвы на свадьбу была прохладной.

«Путин не планирует поздравлять молодоженов», — заявил пресс-секретарь президента Владимира Путина Дмитрий Песков, чья дочь присутствовала на торжестве. «Эта свадьба не имеет ничего общего с нашей повесткой дня».

Поддержка возвращения к монархии в России неоднозначна. По данным независимого Левада-центра, только три процента респондентов опроса 2016 года заявили, что поддержат возвращение к монархической системе до 1917 года. Опрос, проведенный в следующем году государственным ВЦИОМ, показал, что 68 процентов россиян «категорически против самодержавия как формы правления», хотя такое же число молодых людей в возрасте от 18 до 34 лет были «толерантны» к идея монархии.

Через дорогу от собора 57-летняя Ольга лихорадочно фотографировала появившихся свадебных гостей.

«Жаль, что я не знала заранее о свадьбе, я бы пришла раньше, чтобы увидеть это событие», — пожаловалась она, отказавшись назвать свою фамилию. Она сказала, что будет поддерживать тип конституционной монархии Соединенного Королевства, в котором королевская семья играет церемониальную роль выше политики.

Журналист Золотов сказал, что некоторых россиян не впечатлило то, что принесли демократии за 30 лет, и они были бы не прочь попробовать другую модель, хотя и не обязательно снова с Романовыми.

«Для некоторых эта идея очень привлекательна из-за широко распространенного мнения о том, что «демократия в любом случае не работает», — сказал он, отметив, что переход от коммунизма к капитализму в 1990-х годах остается источником национальной травмы и что Россия после двух десятилетий правления г-на Путина вряд ли можно назвать демократическим.

«Восприятие таково: «Какая бы у вас ни была система, вы все равно получите царя, что у русского народа в глубине души монархический менталитет», — сказал он.

Дарья Мальцева — Женский теннис

2019-20 (оставшаяся часть сезона отменена из-за пандемии COVID-19):
• Вышел на первое место в одиночном разряде со счетом 4–4 в общем зачете.3 позиция
• Победы в одиночном разряде одержали победы над WMU, Toledo, FAU и EMU 
. • Набрал 3-4 места в парном разряде, 3-3, а Алекс Уолл занял 2-е (2-1) и 3-е (1-2) места

2018-19:
• Выбор второй команды All-Horizon League
• В одиночном разряде установлен рекорд 13–8, а в чемпионате – 6–2, в основном на втором месте – 91 294. • Зафиксировал рекорд в парном разряде 9-10 с Авой Тильман, выиграв 2-4 в игре лиги, заняв первое место
. • Включена в женскую академическую команду по теннису Horizon League

2017-18:
• Вошел в первую команду All-Horizon League и был назван первокурсником года Horizon League 91 294. • Пошел 6-3 в № 1.1-е место в одиночном разряде в лиге с общим результатом 13-6 между 1-м и 2-м местами
• В команде с Александрой Уолл установила рекорд 7:2 в игре на конференциях, заняв второе место в парном разряде, включая серию из шести побед и общий рекорд 11:10 – 91 294. • Названа лучшим игроком недели в женском одиночном разряде Horizon League со счетом 2 : 0 и первой строчкой в ​​одиночном разряде, выиграв оба матча в сетах подряд, проиграв всего четыре игры, победив Лабину Петровску (Милуоки) 6–1, 6–2 и Терезу Тебон (Грин-Бей). ) 6-0, 6-1, за ее третью и четвертую победу подряд в чемпионате

Средняя школа:
• Два года играл в теннис в Университетском институте Северного Торонто (NTCI) и два года в школе Dr.Средняя школа Джона М. Деннисона
• Признан Федерацией школьных спортивных ассоциаций Онтарио (OFSAA). Бронзовый призер в парном разряде (2017 г.) и смешанном парном разряде (2015 г.)
• Признан MVP тенниса в 2015 году (NTCI) и в 2017 году (Деннисон) – 91 294. • В 2012 году вы выиграли титул чемпиона провинции в одиночном разряде, а также два титула чемпиона провинции в парном разряде 91 294. • Помог клубным теннисным командам Венето и Банбери завоевать чемпионские титулы

Академические достижения:  
• Четырехлетний отбор в почетный список
• Двухгодичный член студенческого совета и президент класса

Личное: Полное имя: Дарья Мальцева
Дата рождения: февр.6, 1999
Родители: Мать Корюкова Алла и Отец Мальцев Андрей
Братья и сестры: Сестра Кристина
Специальность: Международные отношения

Три основные причины выбора Окленда:
1.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.