Логотип сдэк вектор: Логотип СДЭК / Грузоперевозки / TopLogos.ru

Содержание

Доставка

Наша компания осуществляет доставку по территории РФ и стран СНГ.

Доставка по территории РФ

Российская Федерация состоит из 85 равноправных субъектов: 22 из которых являются республиками, 46 - областями и 9 краями. Мы можем доставить товар в любой из этих субъектов!

Краснодар, Майкоп, Челябинск, Уфа, Улан-Удэ, Пенза, Махачкала, Назрань, Великий Новгород, Нальчик, Элиста, Черкесск, Петрозаводск, Сыктывкар, Петропавловск-Камчатский, Йошкар-Ола, Саранск, Якутск, Владикавказ, Казань, Тамбов, Кызыл, Ижевск, Абакан, Чебоксары, Барнаул, Краснодар, Красноярск, Владивосток, Ставрополь, Белгород, Хабаровск, Благовещенск, Архангельск, Астрахань, Брянск, Владимир, Волгоград, Вологда, Воронеж, Иваново, Иркутск, Калининград, Калуга, Кемерово, Киров, Кострома, Курган, Курск, Санкт-Петербург, Липецк, Магадан, Москва, Мурманск, Нижний Новгород, Новосибирск, Омск, Оренбург, Орел, Пермь, Псков, Ростов-на-Дону, Рязань, Самара, Саратов, Южно-Сахалинск, Екатеринбург, Смоленск, Тверь, Томск, Тула, Тюмень, Ульяновск, Чита, Ярославль, Биробиджан, Нарьян-Мар, Дудинка, Ханты-Мансийск, Анадырь, Тура, Салехард, Грозный и это лишь малая часть городов в нашем списке доставки!

Доставка по странам СНГ

Список стран, с которыми мы работаем: Белоруссия, Казахстан, Армения, Азербайджан, Узбекистан, Киргизия

Транспортные компании

С каждым годом количество транспортных компаний увеличивается и на рынке доставки появляется серьезная конкуренция. Уже много лет мы сотрудничаем с лучшими, по нашему мнению, компаниями - это «Деловые линии» и «СДЭК». Крупногабаритные грузы отправляем Деловыми линиями, а более легкие (до 5 кг) и мелкие (до 0,1 м.куб) компанией СДЭК. Для отправки грузов в ближайшее зарубежье мы пользуемся услугами транспортных компаний «Глотус» или «Транслогистик». Данные компании за годы сотрудничества показали свою компетентность, надежность и оперативность. При желании, Вы можете выбрать любую другую транспортную компанию, через которую мы осуществим доставку приобретенного оборудования.

Расчет доставки

Расчет стоимости доставки производится на сайте выбранной транспортной компании.

Для расчета Вам понадобится информации о габаритах и весе оборудования, ее Вы сможете найти в характеристиках товара. Доставка оплачивается при получении заказа.

Стоимость доставки

Москва

Стоимость товара до 10000 р – 500 руб

Стоимость товара более 10000 р –бесплатно

МКАД и Мо - рассчитывается индивидуально и зависит от общей стоимости заказа и километража.

Наш склад

Наш основной склад находится в Московской области в г. Коломна


 

 

СДЭК Пенза ул Центральная 1 к2

Наименование:
Подразделение службы доставки "Экспресс-курьер" (ТК СДЭК, транспортная компания)

Код подразделения:
PNZ2

Адрес:
440004, Российская Федерация, Пензенская область, г. Пенза, ул. Центральная, д. 1 к2, на карте

Номер телефона:
+7 (8412) 98-98-36

Руководитель:
нет данных

Электронная почта:
[email protected]

Официальный сайт:
www.cdek.ru

Пункт выдачи / приёма:
Есть

Весовые ограничения:
0 - 30 кг

Реклама

Офис на карте

Ближайшая остановка: ТЦ «Ритэйл-Парк»
Доехать до остановки ТЦ «Ритэйл-Парк», У входа в гипермаркет «Вектор» с левой стороны

Режим работы

Работает:
Пн. - Пт. - с 10:00 до 20:00
Сб. - Вс. - с 10:00 до 16:00
Без перерыва

Приём и выдача грузов:
Пн.- Вс. - в течение всего рабочего дня

*Рекомендуем перед посещением офиса уточнить по контактным телефонам график приёма

Услуги ПВЗ

  • Выдача заказов;
  • Приём отправлений;
  • Примерочная

Способы оплаты:
5
 
  • Наличные;
  • Банковские карты;
  • Наложенный платеж;
  • Электронные деньги;
  • Платежные терминалы и банкоматы

Срок хранения заказов:

  • в пункте выдачи - 7-14 дней (бесплатно)
  • на складе - до 3-х лет (не востребовано)

Для получения отправления необходимо:

  • документ удостоверяющий личность (например, паспорт)
  • 10-ти значный номер отправления (содержится в SMS при поступлении заказа в ПВЗ)

Отзывы

Пожалуйста, оставьте небольшой отзыв об этом пункте выдачи. Большое спасибо!

Другие офисы города

Оценки и отзывы сотрудников о компании «CDEK IT» за 2020 год — Хабр Карьера

01 декабря 2020. Текущий сотрудник
Стаж от 1 года до 3 лет. Новосибирск. Бэкенд разработчик

Интересные задачи

Современные технологии

Адекватная зарплата

Социальный пакет

Комфортные условия труда

Профессиональный рост

Карьерный рост

Отношения с коллегами

Признание результатов труда

Грамотность менеджмента

Связь с топ-менеджментом

Компания делает мир лучше

Написал т. к. мягко говоря "офигел" от того что пишут. Работаю в компании довольно давно, но половина отзывов вообще с потолка взята. ИТ сильно выросло, много людей, много новых, видимо залетные т.к. в целом команда дружная хоть и большая уже. Есть недостатки, но есть реальные плюсы которые перекрывают наглухо все недостатки. Пока не планирую уходить хоть и звали, все время что-то новое, зп растет, сложность задач растет, технологии меняются, нет мотива валить

Достоинства

хорошая дружная команда, много сильных специалистов

компания начала инвестировать в инструменты и развитие технологий, есть архитекторы, изучают и внедряют новые технологии

белая зп, достойный уровень. Вообще не понял что за люди писали про серую, бред. Премии есть всегда, если хорошо работаешь - никто не жалеет, срезают за реальные косяки, объясняют

живые проекты для работающего крупного бизнеса, есть большая цель. Можно посмотреть как все работает "на земле", прямая ос от пользователей

руководство открыто к конструктивному диалогу, любой человек может выступить с предложением и участвовать во внедрении чего-то нового, проводятся общие встречи, рассказывают обо всем, что происходит в компании, отвечают на вопросы

есть аттестации, можно инициировать самому. Четкие грейды, все по полочкам раскладывают, над чем поработать, а что хорошо

непрерывная работа всей команды ИТ над улучшениями и за 2.5 года очень сильно изменилась картинка

У меня хороший менеджер. Не могу сказать за остальных но вроде тоже в адеквате, бывают рабочие моменты, а где их нет?

Недостатки

соцпакет не Гугл, конечно) скромный ДМС

лично мне не очень удобно местоположение офиса, но сейчас возможна удаленка для любого сотрудника, это решает проблему, ну и опять же это лично для меня

бизнес действительно бодрый мягко говоря, я бы сказал бешеный, надо все и сразу. Это и плохо, но зато бэклог на годы вперёд

PO слабые но за последний год сильно выросли (не все). Продуктовый подход для компании новый, не выстроено еще

Киров - Доставка и оплата

1. Киров Сурикова_4303_С

Адрес: 610035, Киров г, Сурикова ул, д.19, оф. 117

Режим работы: пн-пт 09-13:30, 14-18, сб 10-13:30, 14-14

2. Киров Октябрьский_4304_С

Адрес: 610005, Киров г, Октябрьский пр-кт, д.87

Режим работы: пн-чт 09-19, пт-пт 09-18, сб 10-15

3. Киров Пятницкая_4307_С

Адрес: 610020, Киров г, Пятницкая ул, д.56

Режим работы: пн-пт 09-19, сб 10-15

4. 610998, Кировская, Киров, Производственная улица,

Адрес: 610998, Киров, Производственная улица, 22

Режим работы: пн-пт 08-20, сб 10-16

5. Киров Андрея Упита_4318_С

Адрес: 610050, Киров г, Андрея Упита ул, д.7

Режим работы: пн-пт 12-20, сб 10-14

6. На Московской

Адрес:

Россия, Кировская обл., Киров, ул. Московская (вход с ул. Свободы), 15

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

7. Воровского

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Воровского, 111 Б/5, 4

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

8. Киров Октябрьский_4320_С

Адрес: 610017, Киров г, Октябрьский пр-кт, д.94

Режим работы: пн-чт 09-19, пт-пт 09-18, сб 10-15

9. На Блюхера

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Блюхера, 42

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

10. Киров Маклина_4323_С

Адрес: 610017, Киров г, Маклина ул, д.57

Режим работы: пн-пт 09-20

11. Киров Мостовицкая_4326_С

Адрес: 610025, Киров г, Мостовицкая ул, д.4

Режим работы: пн-вс 10-20

12. Киров Молодой Гвардии_4330_С

Адрес: 610008, Киров г, Молодой Гвардии (Нововятский) ул, д.8

18. Киров Строителей (Радужный)_4339_С

Адрес: 610010, Киров г, Радужный мкр, Строителей пр-кт, д.9а

21. Молодой Гвардии

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Молодой Гвардии, 100

Режим работы: пн-пт 08-20, сб 10-18

23. На Октябрьском

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Октябрьский пр-т, 11

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

24. Киров Архитектора Валерия Зянкина_4352_С

Адрес: 610037, Киров г, Архитектора Валерия Зянкина ул, д.11/1

26. На Ульяновской

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Ульяновская, 30

Режим работы: пн-вс 09-20

27. На Профсоюзной

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Ул. Профсоюзная, 52

Режим работы: пн-вс 09-20

28. ТЦ «АЛЕНКА»

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Воровского, 137б

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

35. мкр. Чистые Пруды

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Мостовицкая, 11

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

37. ЖД Вокзал

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Чапаева, 48

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

38. На Красноармейской

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Ул. Красноармейская, 5

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

39. Нововятский район, ТЦ Вектор

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Советская, 49А

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

41. Киров Студенческий_4368_С

Адрес: 610033, Киров г, Студенческий проезд, д.28, павильон 3

46. Слобода Лосево, 1 (мкр. Солнечный берег)

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Слобода Лосево, 1

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

47. 6415 Постамат ОМНИСДЭК

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Октябрьский пр, 117

Режим работы: пн-вс 00-23:59

48. На Лепсе 58

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Лепсе, 58

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

Лого Одноклассники Вектор - Фото база



Лого Одноклассники Вектор - instructionskins
Лого Одноклассники Вектор - dialweb
Лого Одноклассники Вектор - instructionebay
Odnoklassniki logo PNG
Изображения Одноклассники Значок / tonpix.ru
Подборка интересных и полезных групп в Одноклассниках
Flamingo Logo Png Transparent - Фламинго Вектор Лого ...
Одноклассники | Шаблоны, Лобзик, Шаблоны для выпиливания
Лого Укртелеком Вектор - veteranclub
Здравствуйте уважаемые коллеги! Обращаюсь опять ...
Футбольный клуб из Львова презентовал новый логотип. За ...
Логотип сдэк вектор – Логотипы в векторе: что это такое и ...
Видеозаписи Тверское, мать его, лого / вектор / Corel Draw ...
Тверское, мать его, лого / вектор / Corel Draw | ВКонтакте
Все изображения "Пежо Логотип Вектор" / photo-zhurnal.ru
Лого люди. Обучение людей логотип шаблон — Векторное ...
Няшности пост | Тверское, мать его, лого / вектор / Corel ...
Фрилансер Светлана Абрамова svetlanaabramovaa - Портфолио ...
Ну что? Закроем тему векторных крыльев? Вот.. | Тверское ...
Blog Archives - premiumchannel
Blog Archives - dedalhistory
ᐈ Массаж логотип логотипы, вектор массаж лого | скачать на ...
Логотип сдэк вектор – Логотипы в векторе: что это такое и ...
Логотип сдэк вектор – Логотипы в векторе: что это такое и ...
ᐈ Суши логотип логотипы, вектор суши лого | скачать на ...
А у нас тем временем очередная порция векторного ...

SdeK требуется для развития раннего плодового тела у Myxococcus xanthus

Abstract

Клетки Myxococcus xanthus , несущие вставку Ω4408 Tn 5lac в локусе sde , обнаруживают дефекты в развитии плодового тела и споруляции. Наш анализ паттернов экспрессии sde показал, что этот локус индуцируется на ранних этапах программы развития (от 0 до 2 часов) и что экспрессия увеличивается примерно в пять раз после 12 часов развития.Дальнейшие исследования показали, что экспрессия sde индуцируется, когда растущие клетки входят в стационарную фазу, предполагая, что активация локуса sde не ограничивается процессом развития. Поскольку пиковые уровни экспрессии sde как в sde + , так и в мутантном фоне sde были сходными, мы пришли к выводу, что локус sde не регулируется автоматически. Характеристика локуса sde с помощью анализа последовательности ДНК показала, что вставка Ω4408 произошла в гене sdeK .Анализ удлинения праймера локализовал 5'-конец транскрипта sde на гуаниновом нуклеотиде на 307 п.н. выше предполагаемого начала кодирующей последовательности SdeK. Последовательность ДНК в областях -12 и -24 перед сайтом начала транскрипции sde демонстрирует сходство с семейством промоторов ς 54 . Результаты исследований комплементации предполагают, что дефекты развития и споруляции, вызванные вставкой Ω4408, происходят из-за инактивации sdeK .Было обнаружено, что предсказанная аминокислотная последовательность SdeK имеет сходство с последовательностями гистидиновых протеинкиназ двухкомпонентных регуляторных систем. Основываясь на наших результатах, мы предполагаем, что SdeK может быть частью пути передачи сигнала, необходимого для активации и распространения программы раннего развития.

В ответ на голодание клетки грамотрицательной почвенной бактерии Myxococcus xanthus запускают программу развития, которая завершается формированием куполообразной структуры, называемой «плодовым телом».«Строительство многоклеточного плодового тела требует депривации питательных веществ, скоординированных усилий примерно 10 5 клеток и твердой поверхности. В плодовом теле отдельные клетки дифференцируются в экологически устойчивые и метаболически неподвижные споры (обзоры см. В ссылках 17, 18 и 47).

Развитие плодового тела проходит через серию этапов, которые требуют передачи сигналов между клетками. По крайней мере, пять внеклеточных сигналов (обозначенные как A-сигнал через E-сигнал) необходимы для построения плодового тела, заполненного спорами (6, 10, 28, 29, 40).В нескольких исследованиях изучалось влияние мутаций внеклеточной передачи сигналов на экспрессию онтогенетически регулируемых слияний репортерных генов Tn 5lac (22-24, 27). Результаты этих исследований показывают, что каждый внеклеточный сигнал координирует временную экспрессию уникального набора генов, регулируемых в процессе развития.

Гены, помеченные слияниями Tn 5lac , были расположены на пути развития M. xanthus на основе их временной регуляции с помощью внеклеточных сигнальных событий (23).На ранней стадии пути развития (между 0 и 6 часами) существует два различных класса генов развития: те, которые требуют внеклеточного A-сигнала для полной экспрессии, и те, которые этого не делают. Т.о., по-видимому, происходит бифуркация пути раннего развития на зависимую от A-сигнала ветвь и независимую от A-сигнала ветвь.

Характеристика инсерционных мутантов Tn 5lac показала, что независимое от A-сигнала слияние Ω4408 ингибирует построение нормальных на вид плодовых тел (24, 25).Этот результат предполагает, что вставка Ω4408 Tn 5lac определяет локус, который необходим для формирования плодовых тел, и что независимый от A-сигнала путь важен для распространения программы развития. С этим предположением согласуется открытие, что вставка Ω4408 снижает экспрессию второго локуса, регулируемого развитием, названного « devRS » (25). Недавние исследования показали, что копия локуса devRS дикого типа необходима для прохождения более поздних стадий процесса развития (24, 25, 53).

Нас интересует регуляция экспрессии генов в независимом от A-сигнала пути и то, как продукты этих генов распространяют программу развития. В этой статье мы описываем наш анализ локуса, определяемого вставкой Ω4408 Tn 5lac , обозначенного sde (для индуцированного голоданием, существенного развития). Чтобы понять, как регулируются гены sde , мы исследовали паттерны экспрессии sde в развивающихся и вегетативно растущих клетках и локализовали сайт начала транскрипции для оперона sde .ДНК, фланкирующая Ω4408, была клонирована и охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК и инсерционного мутагенеза для определения того, какой ген в локусе sde требуется для развития плодовых тел.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды.

Полный список штаммов и плазмид, использованных в данном исследовании, представлен в таблице. Плазмиды размножали в Escherichia coli, DH5α (11) или JM101 (34). DK101 является диким типом для развития плодовых тел и споруляции, и он был выбран в качестве родительского для всех штаммов, использованных в этом исследовании, поскольку он несет мутацию sglA1 (14).Аллель sglA1 обеспечивает диспергированный рост в жидких культурах. Предыдущая работа Kroos et al. (24) продемонстрировали, что дефекты развития, вызванные вставкой Ω4408, идентичны как на фоне sglA1 , так и на фоне sglA + , что указывает на то, что эти дефекты вызваны самой вставкой Ω4408 и не зависят от sglA1. Аллель .

ТАБЛИЦА 1

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании

9106 ′ traD36 proAB lacI q Δ lacZ M15 wild 9116 : pJEF4 Кан r , pBGS18, содержащий внутренний sdeK 1.2 kb Nco I- Pst I фрагмент r11422 Kan, pJEF9 8
Штамм или плазмида Соответствующая характеристика Источник или эталон
Штаммы
E.coli
DH5α supE44 ΔlacU169 φ80Δ lacZ M15 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 9
9
34
M. xanthus
DK101 sglA1
sglA1 sdeK :: Tn 5lac Ω4408 24
MS1503 sglA1 Δ sdeK

MS150

sdeK

sdeK
Это исследование
MS1510 sglA1 sde :: pELF1 Это исследование
MS2010 sglA1 trcF :: pBAR101 Настоящее исследование
Плазмиды
pBJ114 Kan R 6 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 49
pBluescript SKII Amp r Stratagene
pPLh443 Kan r 19 r 19 RBB 9001 RBAR
RBB trcF на фрагменте Stu I- Sal I Это исследование
pIMK50 Amp r Kan r , pBluescript SKII, содержащий 9.5 т.п.н. Ω4408 Tn 5lac и 12,5 т.п.н. восходящей ДНК на фрагменте Xho I Это исследование
pIMK51 Amp r , pBluescript SKII, содержащий 50 п.н. ДНК в восходящем направлении на фрагменте Bam HI Это исследование
pELF1 Kan r , pBGS18, содержащий 50 п.н. Ω4408 Tn 5lac и 6 т.п.н. Это исследование
pJEF1 Kan r , pBGS18, содержащий sdeK и 6 т.п.н. восходящей ДНК на Bam HI- Pst I фрагменте Это исследование
pJEF2.5 Kan r , pBGS18, содержащий 25 kb Nco I (в пределах sdeK 9000 Eco6) - sdeK 9000 Eco6 RI фрагмент Это исследование
pJEF3 Kan r , pPLh443, содержащий sdeK и 1 т.п.н. восходящей ДНК на Stu I- Pst I фрагмент pJEF4 Kan r , pPLh443, содержащий sdeK и 1 т.п.н. восходящей ДНК на фрагменте Stu I- Hin dIII Это исследование
pJEF9 1.Фрагмент 9000 п.н. локуса sde (с внутренней делецией Apa I размером 700 п.н.) Это исследование

Штамм MS1503 является производным DK101, несущим делецию 700 п.н. в sde локус. Делеция удаляет 550 п.н. с 5'-конца предсказанной кодирующей последовательности SdeK и дополнительные 150 п.н. восходящей ДНК. Делеция 700 п.н. в MS1503 была сконструирована с помощью двухэтапной процедуры замены гена производным плазмиды pBJ114 (16), названной pJEF9.Плазмида pJEF9 несет ген galK , который может использоваться в качестве контрселекции для потери интегрированной плазмиды, и внутренний фрагмент Eco RI- Hin Hin dIII размером 1,9 т.п.н. из локуса sde . Эта вставка размером 1,9 т.п.н. была получена путем удаления 700 п.н. ДНК из внутренней части фрагмента 2,6 т.п.н. локуса sde . Плазмиду pJEF9 вводили в клетки DK101, как описано ниже, и трансформанты Kan r , которые содержат единственную копию pJEF9, интегрированную путем гомологичной рекомбинации в локусе sde , были идентифицированы с помощью саузерн-блот-анализа (43).Единственное событие интеграции привело к тандемному дублированию с одной неповрежденной копией sdeK и одной копией sdeK с удаленным 5 'концом. После идентификации трансформантов Kan r с одной вставкой плазмиды клетки инокулировали во флаконы, содержащие 5 мл бульона CTT (компоненты приведены ниже), и инкубировали при 32 ° C в течение ночи при энергичном перемешивании. Клетки собирали из ночных культур центрифугированием, ресуспендировали в 500 мкл буфера TPM (компоненты указаны ниже) и аликвотировали на планшеты CTT с добавлением 2% галактозы.В присутствии галактозы экспрессия гена galK из плазмиды pJEF9 является летальной для M. xanthus , и колонии Gal r могут возникать из клеток, которые подверглись операции вырезания плазмиды. Для идентификации изолятов, которые вырезали хромосомную копию плазмиды pJEF9, реплики колоний Gal r высевали на СТТ в присутствии и в отсутствие канамицина. Колонии, которые могли расти только в отсутствие канамицина (Kan s ), были проанализированы дополнительно.Вырезание плазмиды pJEF9 может дать штамм с копией sdeK дикого типа или штамм с делецией на 5'-конце sdeK . Хромосомную ДНК выделяли из колоний Kan s (43) и использовали для саузерн-блот-анализа (43) для идентификации штаммов, несущих делецию.

Средства массовой информации для роста и развития.

штаммов M. xanthus выращивали при 32 ° C в бульоне CTT, содержащем 1% Casitone (Difco Laboratories), 10,0 мМ Трис-гидрохлорид (pH 8.0), 1 мМ KH 2 PO 4 и 8 мМ MgSO 4 или на чашках, содержащих бульон CTT и 1,5% бакто-агар Difco. К бульону СТТ и планшетам СТТ добавляли 40 мкг сульфата канамицина на мл (Sigma) или 2% галактозы (Sigma) по мере необходимости. Мягкий агар CTT - это бульон CTT, содержащий 0,7% бакто-агара Difco. E. coli DH5α и JM101 выращивали при 37 ° C в бульоне Лурия-Бертани (LB), содержащем 1% триптона (Difco), 0,5% дрожжевого экстракта (Difco) и 0,5% NaCl, или на чашках, содержащих LB и 1.5% Бакто-агар Difco. В чашки LB и LB добавляли 50 мкг ампициллина на мл (Sigma) или 40 мкг сульфата канамицина на мл (Sigma) по мере необходимости. Развитие плодовых тел проводили при 32 ° C на чашках TPM, содержащих буфер TPM (10,0 мМ Трис-гидрохлорид [pH 8,0], 1 мМ KH 2 PO 4 и 8 мМ MgSO 4 ) и 1,5% Difco Bacto. -Агар.

Тесты на β-галактозидазу, развитие и споруляцию.

Для сбора вегетативно растущих клеток, M.Штаммы xanthus инокулировали в колбу, содержащую 10 мл бульона СТТ, и культуру помещали при 32 ° C с интенсивным перемешиванием. В разное время после того, как культура достигла плотности 2 × 10 8 клеток на мл, аликвоты по 500 мкл были удалены и быстро заморожены в жидком азоте. Клетки развития собирали из чашек с агаром TPM, как описано ранее (24), и анализы β-галактозидазы проводили с быстрозамороженными клеточными экстрактами (20). Удельная активность β-галактозидазы определяется как наномоль o -нитрофенола (ONP), продуцируемого за минуту -1 миллиграмма белка -1 .

Развитие плодовых тел на чашках с агаром TPM контролировали визуально с помощью препаровального микроскопа (Wild-Heerbrug). Для проверки эффективности споруляции использовали два метода. Сначала с помощью счетной камеры Петрова-Хауссера и фазово-контрастной микроскопии определяли количество яйцевидных спор с яркой фазой, продуцируемых развивающимися клетками. Во-вторых, жизнеспособность этих спор определялась, как описано ранее (53). Из-за ежедневных колебаний абсолютного количества спор анализы спор представлены в процентах от количества спор дикого типа для каждого эксперимента.Стопроцентная споруляция дикого типа составляла от 2 × 10 6 до 2 × 10 7 спор / мл, что соответствует эффективности споруляции от 1 до 10% в зависимости от количества введенных клеток.

Анализ РНК.

Для выделения РНК во время роста клеток M. xanthus инокулировали в бульон CTT, и культуру помещали при 32 ° C при энергичном встряхивании. Клетки собирали в разное время после того, как культура достигла плотности 2 × 10 8 клеток на мл.Для выделения онтогенетической РНК примерно 5 × 10 10 клеток собирали с чашек с агаром TPM, как описано ранее (20). После сбора вегетативно растущие клетки и развивающиеся клетки быстро замораживали в жидком азоте, как описано выше для анализов β-галактозидазы. РНК выделяли из быстрозамороженных клеток методом горячего фенола (43). Общую клеточную РНК использовали в гибридизации слот-блоттинга, как описано Kaplan et al. (20). Для экспериментов по гибридизации слот-блоттинга использовали два зонда: фрагмент Apa I, содержащий 300 п.н. ДНК, непосредственно перед сайтом вставки Ω4408, и фрагмент Nco I- Pst I, содержащий 1.2 т.п.н. ДНК ниже сайта вставки Ω4408. Аналогичные результаты были получены с обоими зондами. Специфичность этих зондов была подтверждена с использованием мРНК дрожжей, которая не давала детектируемого сигнала. Анализ удлинения праймера проводили, как описано ранее (15), с модификациями Mirel и Chamberlin (36). В качестве праймеров для этих анализов использовали 5'-GCCACCCTAACCCCGCAGCA-3 'и 5'-ACACTCCCTTCATACAGACGCAG-3'. Оба праймера были синтезированы Operon Technologies, Inc. (Аламеда, Калифорния.).

Перенос плазмиды в
M. xanthus.

Плазмиды, содержащие фрагменты ДНК из локуса sde , электропорировали в клетки DK101 или MS1503 по методике Plamann et al. (41). Саузерн-блот-анализ (43) был использован для идентификации электропорантов, которые содержат единственную копию соответствующей плазмиды, интегрированную посредством гомологичной рекомбинации в локус sde , или единственную копию соответствующей плазмиды, интегрированную посредством сайт-специфической рекомбинации в прикрепление хромосомного фага Mx8. сайт ( attB ).Электропоранты Kan r , несущие вставку одной плазмиды, оценивали на развитие и эффективность споруляции, если это необходимо.

Клонирование локуса
sde .

Для выделения хромосомной ДНК выше (относительно транскрипции lacZ ) слияния и вставки Ω4408 Tn 5lac , геномную ДНК получали из штамма DK4408 (43), расщепляли Xho I и лигировали в Xho. I-расщепленная плазмида pBluescript SKII. Смесь для лигирования ДНК подвергали электропорации в E.coli , как описано ранее (43), и колонии Kan r были идентифицированы на чашках LB, содержащих канамицин. Плазмидную ДНК выделяли из ночных культур, выращенных в чашках LB с добавлением канамицина, как описано Sambrook et al. (43). Один клон, плазмида pIMK50, который содержит вставку размером 22 т.п.н., был идентифицирован путем расщепления плазмидной ДНК соответствующими рестрикционными ферментами. Впоследствии фрагмент Bam HI из pIMK50 с 50 п.н. на 5'-конце Ω4408 Tn 5lac и 6 т.п.н. хромосомной ДНК перед вставкой был идентифицирован рестрикционным анализом, очищен и лигирован в Bam HI- расщепленный pBluescript SKII с получением плазмиды pIMK51.Чтобы подтвердить, что приблизительно 6 т.п.н. ДНК, клонированная в pIMK51, идентична ДНК, расположенной выше хромосомной вставки Ω4408, этот фрагмент Bam HI размером 6 т.п.н. использовали в качестве зонда для саузерн-блот-анализа (43). Хромосомную ДНК, полученную из штамма DK4408, расщепляли Sma I, Sal I, Xho I, Eco RI или Pst I, разделяли на 0,8% агарозном геле и наносили на нейлоновую мембрану. Зонд Bam HI размером 6 т.п.н., полученный из pIMK51, показал картину гибридизации, идентичную той, которая была получена, когда тот же блот зондировали 5'-концом Tn 5lac .Рестрикционная карта, полученная в результате этого саузерн-блоттинга, была аналогична карте, построенной ранее Kroos et al. (24) для ДНК перед вставкой Ω4408.

Метод клонирования in situ был использован для выделения хромосомной ДНК ниже по течению (относительно транскрипции lacZ ) слияния и вставки Ω4408 Tn 5lac , как описано Gill et al. (9) и Стивенс и Кайзер (50). Трансформанты Kan r штамма DK101, содержащие единственную вставку плазмиды pELF1 или pJEF2 в локус sde , выделяли, как описано выше.После идентификации трансформантов Kan r с единичным событием вставки хромосомную ДНК выделяли и расщепляли Pst I или Eco RI для pELF1 и pJEF2, соответственно. Затем каждый хромосомный гидролизат самолигировали и электропорировали в E. coli DH5α (43). Электропорированные клетки высевали на планшеты LB, содержащие канамицин, и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Плазмидную ДНК выделяли и расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами для подтверждения состава клонов.Один клон (плазмида pJEF1) несет вставку размером 7,7 т.п.н. с 6 т.п.н. хромосомной ДНК перед сайтом вставки Ω4408 и 1,7 т.п.н. хромосомной ДНК ниже сайта вставки Ω4408. Второй клон (плазмида pJEF2.5) несет вставку размером 25 т.п.н. с 1,2 т.п.н. ДНК sdeK и приблизительно 24 т.п.н. Ни одна из плазмид не содержит ДНК Tn 5lac .

Анализ последовательности ДНК. ДНК

секвенировали методом терминации дидезоксинуклеотидной цепи (44) с помощью набора для циклического секвенирования Sequi-Therm (Epicenter Technologies, Madison, Wis.) и специально разработанные олигонуклеотидные праймеры, синтезированные Operon Technologies, Inc. Таким образом определяли нуклеотидную последовательность обеих цепей в области 6,3 т.п.н. в локусе sde . Последовательность ДНК анализировали с помощью программного обеспечения ABI prism и собирали с помощью программного обеспечения Deneba Sequencher. Последовательности белков анализировали с помощью программы TMpred для поиска гидрофобных и потенциальных доменов, проникающих через мембрану.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фенотипы мутанта Ω4408.

Развитие плодового тела в М.xanthus сопровождается рядом легко наблюдаемых морфологических и поведенческих изменений (рис.). Эти изменения включают агрегацию клеток, образование холмика и созревание спор. Kroos et al. (24, 25) сообщили, что вставка Ω4408 Tn 5lac в локус sde блокирует развитие плодового тела и спороношение. Для дальнейшего изучения этих поведенческих и морфологических дефектов, вызванных Ω4408, клетки изогенных штаммов DK101 и DK4408 (DK101 :: Tn 5lac Ω4408) были нанесены на агаре TPM для анализа развития.Сравнение фенотипов развития для каждого штамма показано на рис. Агрегация клеток DK4408 началась примерно в то же время (8 ч), что и агрегация клеток DK101 дикого типа. Однако агрегаты клеток DK101 образовывали бугорчатые структуры после 24 часов развития, в то время как агрегаты клеток DK4408 не могли уплотняться в холмики в течение 48 часов этого развития. Между 12 и 24 часами развития агрегаты DK4408 диссоциировали на невыразительные, полупрозрачные маты клеток, тогда как скопления клеток DK101 развивались в затемненные плодовые тела, заполненные спорами.

Поведение клеток M. xanthus во время развития на чашках с агаром TPM. Показан прогресс развития клеток DK101 дикого типа, клеток DK4408, клеток MS1503 и клеток MS1506. Клетки наносили на голодный агар TPM и контролировали визуально, как описано в разделе «Материалы и методы». Фотографии были сделаны в указанное время.

Два метода использовали для анализа эффективности споруляции клеток DK4408 и DK101, развивающихся на чашках с агаром TPM в течение 5 дней. Чтобы определить количество термостойких и устойчивых к ультразвуку яйцевидных спор, продуцируемых развивающимися клетками, мы использовали счетную камеру Петрова-Хауссера и фазово-контрастную микроскопию.Чтобы проверить жизнеспособность этих спор, мы поместили их на СТТ-агар и подсчитали количество возникших колоний. Результаты анализов споруляции сведены в таблицу. Эти два метода дали похожие результаты; количество спор, продуцируемых клетками DK4408, составляло примерно 0,8% от количества спор, продуцируемых клетками DK101, а количество жизнеспособных спор из клеток DK4408 составляло примерно 0,1% от количества спор, продуцируемых клетками DK101.

ТАБЛИЦА 2

Фенотипы развития штаммов дикого типа и мутантных штаммов a

Штамм Наличие развития плодовых тел b % спор дикого типа c % диких жизнеспособные споры d
DK101 +100.0 ± 7,7 100,0 ± 19,5
DK4408 - 0,8 ± 0,3 0,1 ± 0,1
MS1503 - 0,1 ± 0,1 0,2 + 117,1 ± 9,7 90,0 ± 39,2
MS2010 + ND e 100 f
Выражение
в процессе роста и развития.

Вставка Ω4408 Tn 5lac в DK4408 ставит lacZ под транскрипционный контроль промотора в локусе sde . Используя это слияние репортерного гена lacZ , мы исследовали экспрессию sde в клетках DK4408, развивающихся на агаре TPM (фиг. A). Удельная активность β-галактозидазы начала возрастать в течение 2 ч после инициированного голоданием развития плодовых тел. Пиковая удельная активность β-галактозидазы наблюдалась примерно через 12 часов развития, и эти уровни оставались относительно неизменными в течение следующих 36 часов.Уровень специфической активности β-галактозидазы через 12 часов развития примерно в пять раз выше, чем в начале программы развития. Чтобы изучить экспрессию sde во время вегетативного роста, мы проанализировали специфическую активность β-галактозидазы в клетках DK4408, помещенных в жидкую среду CTT. На рисунке B показано, что удельная активность β-галактозидазы начала увеличиваться во время перехода от экспоненциального роста к стационарной фазе и что удельная активность β-галактозидазы продолжала увеличиваться и в стационарную фазу.Пик удельной активности β-галактозидазы, наблюдаемый в стационарной фазе, примерно в три раза выше, чем пик, наблюдаемый в экспоненциальной фазе. Эти данные показывают, что экспрессия sde индуцируется как в развивающихся клетках, так и в вегетативных клетках, вступающих в стационарную фазу.

Паттерны выражения sde . Средние значения удельной активности β-галактозидазы, обнаруженные в клетках DK4408, и средние уровни мРНК sde , обнаруженные в клетках DK101, были определены в трех независимых экспериментах.Планки погрешностей - это стандартные отклонения от среднего. Белые квадраты представляют собой удельную активность β-галактозидазы, а закрашенные ромбики представляют плотность клеток. Показаны средние удельные активности β-галактозидазы, обнаруженные в указанные моменты времени во время развития на агаре TPM (A) и во время вегетативного роста в бульоне CTT (B). Среднее кратное увеличение удельной активности β-галактозидазы (■) и среднее кратное увеличение мРНК sde () сравнивают для периода развития от 0 до 12 часов на чашках с агаром TPM и от 0 до 53 часов роста в жидкости CTT ( C).

Чтобы определить, происходит ли увеличение специфической активности β-галактозидазы, наблюдаемое во время роста и развития клеток DK4408, на уровне накопления мРНК sde , использовали анализ гибридизации слот-блоттинга РНК. Общую РНК очищали из клеток DK101 во время развития на агаре TPM и роста в среде CTT. РНК переносили на нейлоновые мембраны и зондировали фрагментом Apa I длиной 300 п.н., содержащим ДНК, непосредственно перед сайтом вставки Ω4408 (рис.), и были определены относительные уровни мРНК sde . Результаты, показанные на фиг. C, показывают, что относительное увеличение мРНК sde во время роста и развития аналогично относительному увеличению специфической активности β-галактозидазы. Более того, эти находки показывают, что экспрессия sde не изменяется на фоне мутанта sde + или sde , что позволяет предположить, что этот локус не саморегулируется.

Физическая карта области вставки Ω4408.Расширенная черная линия указывает на область, которая была охарактеризована анализом последовательности ДНК. Прямоугольники показывают расположение указанной ORF. Стрелка внутри каждого поля показывает предполагаемую ориентацию транскрипции ORF. Местоположение вставки Ω4408 (треугольник) определяли секвенированием ДНК и саузерн-блоттингом, как описано в разделе «Материалы и методы». Увеличенное изображение Tn 5lac показано над треугольником. Плазмиды, содержащие указанные фрагменты ДНК локуса sde , показаны под картой области вставки Ω4408.Скобки указывают степень удаленной области в плазмиде pJEF9, а параллельные косые черты указывают непрерывную последовательность ДНК, которая простирается до сайта Eco RI, примерно на 24 т.п.н. ниже конца ORF sdeK . Фрагмент Apa I длиной 300 п.н. и фрагмент Nco I- Pst I размером 1,1 т.п.н., использованные для анализа гибридизации слот-блоттинга мРНК sde , представлены пунктирными прямоугольниками.

Клонирование локуса
sde .

В предыдущем исследовании Kroos et al.(24) картировали несколько сайтов рестрикции в ДНК выше (относительно транскрипции lacZ ) от вставки Ω4408. Фермент рестрикции Xho I разрезает один раз в пределах Ω4408 Tn 5lac и один раз на небольшом расстоянии перед вставкой, генерируя хромосомный фрагмент размером 22 т.п.н. с 9,5 т.п.н. Ω4408 Tn 5lac и приблизительно 12,5 т.п.н. .). Тот факт, что 9,5 т.п.н. Ω4408 Tn 5lac на этом фрагменте Xho I содержит ген, придающий устойчивость к канамицину ( nptII ), позволил нам идентифицировать плазмиду (pIMK50), несущую вставку Xho I размером 22 т.п.н. .Фрагмент Bam HI размером 6 т.п.н. из плазмиды pIMK50 субклонировали в pBluescript SKII и в pBGS18 с получением плазмид pIMK51 и pELF1 соответственно. Этот фрагмент Bam HI размером 6 т.п.н. впоследствии использовали в качестве зонда для саузерн-блот-анализа (данные не показаны), и анализ последовательности ДНК использовали для подтверждения того, что он содержит 50 п.н. от 5'-конца Ω4408 Tn 5lac и 6 т.п.н. хромосомной ДНК перед этой вставкой.

Метод клонирования in situ был использован для выделения хромосомной ДНК ниже Ω4408 Tn 5lac .Плазмиду pELF1 вводили в штамм DK101 электропорацией и выделяли колонии Kan r для дальнейшего анализа. Один изолят Kan r (MS1510), как показал Саузерн-блот-анализ, несет единственную копию плазмиды pELF1, интегрированную в хромосому путем гомологичной рекомбинации (данные не показаны). Результаты анализа саузерн-блоттинга показали, что рестрикционный фермент Pst I разрезает один раз в пределах сайта мультиклонирования pELF1 и один раз на 1,7 т.п.н. ниже сайта встраивания плазмиды.Таким образом, путем переваривания хромосомной ДНК, полученной из MS1510 с Pst I, и лигирования пула из фрагментов Pst I, мы создали плазмиду (pJEF1), которая несет хромосомную ДНК размером 6 т.п.н. перед сайтом вставки Ω4408, 1,7 т.п.н. ДНК ниже сайта вставки Ω4408, а ДНК Ω4408 Tn 5lac отсутствует (рис.). Состав pJEF1 подтвержден рестрикционным анализом и секвенированием ДНК. Для получения дополнительных 24 т.п.н. ДНК ниже сайта Pst I использовали аналогичную процедуру (см. Материалы и методы).Полученный клон, содержащий эту дополнительную ДНК, был обозначен как pJEF2.5.

Анализ последовательности ДНК локуса
sde .

Область 6,3 т.п.н. нативного локуса sde от расположенного выше сайта Eag I до нижележащего сайта Hin dIII была охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК (рис. [Номер доступа GenBank {"тип": " entrez-nucleotide "," attrs ": {" text ":" AF031084 "," term_id ":" 2736295 "," term_text ":" AF031084 "}} AF031084]). Эта область ДНК охватывает 4.На 1 т.п.н. выше и на 2,2 т.п.н. ниже сайта вставки Ω4408. Были идентифицированы две открытые рамки считывания (ORF), первоначально обозначенные ORF1 и ORF2. Обе ORF имеют сильное смещение в сторону нуклеотидов G + C в третьем положении кодонов (92,7% для ORF1 и 89,2% для ORF2), что типично для генов в M. xanthus и других организмах с высоким G + C ( 3, 47).

ORF1 размером 3,6 т.п.н. расположен выше сайта вставки Ω4408, и предполагается, что он транскрибируется в противоположной ориентации относительно lacZ из слияния Ω4408 Tn 5lac .Это говорит о том, что ORF1 не является частью оперона, определенного Ω4408. Выведенная аминокислотная последовательность продукта ORF1 показывает 44% идентичности и 64% сходства с фактором связывания репарации транскрипции E. coli , TrcF (45, 46). В E. coli TrcF участвует в специфической для цепи репарации повреждений ДНК, которые блокируют транскрипцию с помощью РНК-полимеразы. Мы переименовали ORF1 в « trcF » на основании этого сильного сходства последовательностей.

ORF2 размером 1,6 т.п.н., по прогнозам, будет транскрибироваться в той же ориентации относительно lacZ из слияния Ω4408 Tn 5lac .Кроме того, анализ последовательности ДНК показал, что сайт вставки Ω4408 находится на 5'-конце ORF2, что указывает на то, что ORF2 является частью оперона, определяемого Ω4408. С-концевые 228 остатков предполагаемого продукта ORF2 демонстрируют сильное сходство и идентичность с доменом трансмиттера в белках гистидинкиназы. Белки гистидинкиназы действуют как сенсоры в двухкомпонентных системах передачи сигналов, а консервативный остаток гистидина, который часто обнаруживается в передающем домене этих белков, фосфорилируется в ответ на конкретный внутриклеточный или внеклеточный сигнал.В передающем домене этих сенсорных белков идентифицированы четыре высококонсервативных участка (38, 51). Область H содержит остаток гистидина, который служит сайтом аутофосфорилирования, а область G, как полагают, функционирует как сайт связывания нуклеотидов (38, 51). Конкретная функция еще не назначена региону N или региону D / F. Выравнивания последовательностей, показанные на фиг. 1, показывают, что ORF 2 (обозначенная как SdeK для индуцируемой голоданием, необходимой для развития киназы) содержит все четыре из этих консервативных областей.

Выравнивание С-конца SdeK с консервативными областями в домене трансмиттера известных белков гистидинкиназы. Консервативные последовательности FixL из Rhizobium meliloti (1, 5), KinA из Bacillus subtilis (2, 39), KinB из B. subtilis (54), NtrB из E. coli (35), PhoR из E. coli (30) и SdeK из M. xanthus . Показаны четыре высококонсервативные области (H-Box, N-Box, D / F-Box и G-Box) в белках гистидинкиназ (38, 51).Аминокислотные остатки, обнаруженные в 10-100% белков гистидинкиназы, представлены над выравниванием последовательностей, как представлено Stock et al. (51). Черные прямоугольники показывают, что остаток абсолютно консервативен среди всех гистидинкиназ. Темно-серые прямоугольники показывают, что остаток обнаружен в 75-98% гистидинкиназ. Светло-серые прямоугольники показывают, что остаток обнаружен в 10-74% гистидинкиназ.

Выведенная аминокислотная последовательность в N-концевой части SdeK не показала значительного сходства с последовательностями белков в базе данных GenBank.Однако предыдущие анализы показали, что аминокислотные последовательности N-концевой области гистидинкиназ не очень консервативны (38). Это отсутствие консервативности согласуется с предполагаемой функцией N-концевой области как входных доменов, которые изменяют активность каждого белка в ответ на конкретный сигнал. Дальнейший анализ N-концевой области SdeK не выявил гидрофобных трансмембранных областей, что позволяет предположить, что SdeK может локализоваться в цитоплазматическом компартменте M.xanthus клеток. Таким образом, SdeK может принадлежать к семейству белков цитоплазматической гистидинкиназы с N-концевым входным доменом, за которым следует C-концевой передающий домен. Некоторыми из членов этого семейства белков являются DegS из Bacillus subtilis (13, 26), KinA из Bacillus subtilis (2, 39), NifL из Azotobacter vinelandii (4, 42) и NtrB из . E. coli (35).

5'-конец ORF sdeK определяется стоп-кодоном TAG (+169, рис.А). Поскольку N-концевой домен не консервативен в гистидинкиназах, анализ последовательности не помогает определить начало трансляции SdeK. 5'-конец ORF sdeK содержит два потенциальных сайта связывания рибосом для инициации трансляции белка SdeK. Первый предполагаемый сайт связывания рибосомы отделен от нижележащего кодона GTG (+307, рис. A) 3 нуклеотидами, тогда как второй предполагаемый сайт отделен 8 нуклеотидами от кодона CTG (+238, рис. A). Поскольку GTG чаще используется в качестве кодона инициации трансляции, чем CTG (7), мы предполагаем, что нижележащий сайт на +307 является вероятным началом кодирующей последовательности белка SdeK.

(A) Последовательность ДНК области перед вставкой Ω4408 Tn 5lac . Черный треугольник показывает расположение вставки Ω4408. Изогнутая стрелка над +1 показывает 5'-конец предсказанного транскрипта sde , и обозначены области -12 и -24. Стоп-кодон (TAG), который определяет 5'-конец ORF sdeK (+169), показан в нижнем регистре. Потенциальные сайты связывания рибосом и стартовые кодоны трансляции для белка SdeK выделены жирным шрифтом.Нуклеотиды, отмеченные звездочкой, комплементарны 3'-концу 16S рРНК M. xanthus (37). Пунктирная стрелка над GTG в позиции +307 - это предполагаемое начало кодирующей последовательности SdeK. Подчеркнутые области показывают последовательности, которые комплементарны двум праймерам (ORF12 и ORF12-2), используемым для идентификации 5'-конца транскрипта sde . (B) Картирование 5'-конца онтогенетического транскрипта sde с помощью анализа удлинения праймера. A, C, G и T показывают лестницы секвенирования ДНК.PE, удлинение праймера с помощью общей РНК, полученной из клеток DK101, развивающихся на агаре TPM в течение 12 ч, и праймера ORF12 (материалы и методы). (C) Сравнение промоторной области sde с консенсусной последовательностью ς 54 и тремя промоторами M. xanthus ς 54 : mbhA (21), 4521 (21) и pilA . (55). Предлагаемое начало транскрипции обозначено знаком +1.

Локализация 5'-конца транскрипта развития
sde .

Последовательность ДНК локуса sde убедительно свидетельствует о том, что ген sdeK является первым геном в транскрипционной единице sde . Для идентификации 5'-конца онтогенетического транскрипта sde был проведен анализ удлинения праймера с 12-часовым (время, когда были обнаружены пиковые уровни мРНК sde ) онтогенетической РНК и праймером (ORF12), который комплементарен область вокруг предполагаемого стартового кодона для SdeK (рис. A). На рисунке B показано, что 5'-конец мРНК sde картирован с гуаниновым нуклеотидом на 307 п.н. выше предполагаемого начала кодирующей области SdeK.В аналогичном эксперименте по удлинению праймера со вторым праймером (ORF12-2) тот же 5'-конец был обнаружен для мРНК sde (данные не показаны). Анализ этого участка длиной 307 п.н. перед sdeK не выявил очевидной ORF, что позволяет предположить, что sdeK является первым геном в транскрипте sde .

Исследование 5'-области, предшествующей предполагаемому сайту старта транскрипции для оперона sde , выявило последовательность, сходную с семейством промоторов ς 54 (52) (рис.C). Сходство наиболее сильно в области -24, где 5 из 7 нуклеотидов идентичны консенсусной последовательности ς 54 . Сходство менее сохраняется в районе -12, только 2 из 5 совпадают с консенсусом. Однако обнаружены высококонсервативные динуклеотиды GG в области -24 и GC в области -12. Сходства с другими семействами бактериальных промоторов не наблюдалось.

Идентификация гена в локусе
sde , который необходим для развития и споруляции.

Анализ последовательности ДНК показал, что вставка Ω4408 Tn 5lac расположена внутри кодирующей последовательности sdeK . Поскольку sdeK и trcF , по-видимому, находятся в расходящихся оперонах, это открытие подразумевает, что блокировка развития, вызванная Ω4408, не является результатом инактивации гена trcF . Наиболее правдоподобным объяснением фенотипа Ω4408 является инактивация функции sdeK или полярный эффект на ген или гены, расположенные ниже sdeK .

Чтобы подтвердить, что инактивация trcF не отвечает за фенотип Ω4408, мы сконструировали штамм MS2010 и исследовали его способность образовывать плодовые тела и спорулировать (таблица). MS2010 является производным штамма DK101, содержащего вставку плазмиды pBAR101 в хромосому. Вставка в MS2010 дает две неполные копии гена trcF . При помещении на чашки с агаром TPM клетки MS2010 образовывали нормальные на вид плодовые тела через 24 часа развития, и количество жизнеспособных спор, продуцируемых этими плодовыми телами, было сходным с количеством жизнеспособных спор, продуцируемых плодовыми телами дикого типа DK101.Эти данные показывают, что инактивация гена trcF не отвечает за задержку развития, наблюдаемую для мутанта с инсерцией Ω4408.

Чтобы определить, вызваны ли дефекты развития, вызванные вставкой Ω4408, инактивацией гена sdeK , мы сконструировали штамм, обозначенный MS1503, который несет делецию в sdeK sdeK ). Эта делеция удаляет 550 п.н. с 5'-конца предполагаемой кодирующей области SdeK, включая предполагаемые сайты инициации трансляции, а также дополнительные 150 п.н. восходящей ДНК.Когда в качестве зонда для анализа гибридизации слот-блоттинга использовали фрагмент ДНК, расположенный ниже делеции 700 п.н., мРНК sde не была обнаружена в мутанте MS1503 (данные не показаны), что указывает на то, что делеция имеет полярный эффект на нижестоящая транскрипция. Для изучения дефектов развития, вызванных Δ sdeK , клетки MS1503 анализировали на предмет развития и сравнивали с клетками DK101 и DK4408 (рис.). Клетки всех трех штаммов начали агрегироваться примерно в одно и то же время, но клетки DK4408 и клетки MS1503 не смогли сплотиться в холмики после 48 часов развития.Кроме того, количество спор и количество жизнеспособных спор, продуцируемых штаммом MS1503, было примерно в 1000 раз ниже, чем у штамма дикого типа DK101, и аналогично таковым в штамме DK4408 (таблица). Таким образом, дефекты развития и споруляции, наблюдаемые штаммом Δ sdeK , подобны дефектам, вызванным вставкой Ω4408.

Чтобы продемонстрировать, что потеря функции sdeK является ответственной за фенотипы развития, наблюдаемые для штамма MS1503, мы попытались дополнить мутацию плазмидой pJEF4, которая содержит копию sdeK дикого типа, а также последовательности ДНК, расположенные выше по течению, необходимые для управления экспрессией этого гена.Кроме того, плазмида pJEF4 несет сайт Mx8 attP для интеграции в сайт прикрепления хромосомного фага Mx8, attB . Эту плазмиду вводили в штамм MS1503, давая штамм MS1506. Клетки MS1506 были проанализированы на предмет развития и сравнены с клетками DK101 и MS1503, чтобы определить, может ли копия гена sdeK дикого типа устранить дефекты, вызванные мутацией Δ sdeK (рис.). Клетки MS1506 агрегировались примерно в то же время, что и клетки DK101 дикого типа.Однако для полного уплотнения этих агрегатов в затемненные плодовые тела потребовалось 48 часов, тогда как клеткам DK101 потребовалось всего 24 часа. Когда мы исследовали эффективность споруляции штамма MS1506 через 5 дней, мы обнаружили, что она аналогична таковой у штамма DK101 (таблица). Эти данные показывают, что дефекты развития и споруляции, вызванные мутацией Δ sdeK , могут быть дополнены путем предоставления копии гена sdeK дикого типа на эктопическом участке, хотя развитие, по-видимому, немного задерживается.Наши результаты предполагают, что онтогенетический блок, продуцируемый вставкой Ω4408, обусловлен инактивацией гена sdeK , а не полярным эффектом на ген, расположенный ниже sdeK .

ОБСУЖДЕНИЕ

Tn 5lac транскрипционные слияния были использованы Кроосом и Кайзером (22) для идентификации приблизительно 30 онтогенетически регулируемых локусов в хромосоме M. xanthus . Экспрессия восьми слияний Tn 5lac индуцируется в течение нескольких часов после того, как голодание инициирует программу развития (24).Среди этих восьми ранних слияний Ω4408 Tn 5lac является уникальным, потому что сама вставка производит блок развития (24, 25). Таким образом, вставка Ω4408 определяет генетический локус, который абсолютно необходим для прохождения через цикл развития. Мы обозначили этот локус sde , и в этом отчете мы рассмотрели его регуляцию и его потенциальную функцию в развитии.

Экспрессия
sde индуцируется, когда клетки начинают развитие и когда клетки входят в стационарную фазу.

Экспрессия из слияния Ω4408 Tn 5lac индуцируется на ранних этапах программы развития M. xanthus (от 0 до 2 часов), задолго до появления первых видимых признаков клеточной агрегации. Пик экспрессии sdeK не наблюдался до примерно 12 часов развития, когда агрегаты клеток уплотняются в холмики. После 12 ч развития уровень экспрессии sde оказался примерно в пять раз выше, чем в начале развития.Дальнейший анализ экспрессии Ω4408 показал, что индукция sde происходит, когда растущие клетки начинают входить в стационарную фазу. Экспрессия sde продолжала увеличиваться в стационарной фазе, давая пиковую индукцию примерно в три раза. Эти результаты показывают, что индукция sde не ограничивается программой развития M. xanthus . Наше открытие, что уровни экспрессии sdeK схожи как у sdeK + , так и у мутантного фона sdeK , предполагает, что sdeK не регулируется ауторегулируется.

Какое событие приводит к активации локуса sde ? Результаты наших исследований экспрессии предполагают, что sde может индуцироваться, когда уровни питательных веществ недостаточны для поддержания устойчивого роста. Предыдущие результаты согласуются с этой гипотезой. Например, Сингер и Кайзер (48) и Харрис и др. (12) показали, что экспрессия Ω4408 Tn 5lac зависит от высоких уровней сигнала внутриклеточного голодания (p) ppGpp. Более того, условия, которые активировали экспрессию sde в наших исследованиях, коррелируют с условиями, ранее показанными для генерации относительно высоких уровней (p) ppGpp (31–33).Таким образом, локус sde может экспрессироваться прямо или косвенно в ответ на сигнал голодания (p) ppGpp.

5'-конец транскрипта
sde расположен на 307 п.н. выше предполагаемого стартового кодона для SdeK.

Результаты анализа удлинения праймера с онтогенетической РНК показали, что 5'-конец транскрипта sde расположен на 307 п.н. выше предполагаемой кодирующей области SdeK. Поскольку этот участок длиной 307 пар оснований, по-видимому, не содержит истинной ORF, мы полагаем, что sdeK является первым геном в опероне sde .Это открытие предполагает, что мРНК sde имеет относительно длинную лидерную последовательность. Аналогичный результат наблюдали Fisseha et al. (8), которые предположили, что мРНК Ω4403, зависящая от С-сигнала, имеет лидерную последовательность из 142 п.н. Лидер sde потенциально может участвовать в регуляции экспрессии sde либо на уровне транскрипции, либо на уровне трансляции. Альтернативно, он может участвовать в регуляции стабильности мРНК sde .

Последовательность ДНК перед началом транскрипции для sde имеет сходство с семейством промоторов ς 54 .Этот класс промоторов имеет идентичность последовательностей в областях -12 и -24, при этом динуклеотид GC в области -12 и динуклеотид GG в области -24 являются высококонсервативными (52). Предполагаемый промотор для sde содержит эти два консервативных динуклеотида и имеет сильную идентичность с консенсусной последовательностью в области -24 (5 из 7 нуклеотидов). Недавняя работа Keseler и Kaiser (21) предполагает, что два онтогенетически регулируемых гена, mbhA и 4521 , имеют промоторы, подобные ς 54 .Основываясь на своих выводах, они предположили, что развитие у M. xanthus может регулироваться каскадом или серией положительных активаторов, использующих один и тот же холофермент РНК-полимеразы ς 54 (21). Хотя временная регуляция этих трех генов во время развития схожа, каждый из них имеет уникальные требования для полной экспрессии. Например, mbhA и 4521 требуют внеклеточного A-сигнала для полной экспрессии, а sde - нет (27, 29).Кроме того, mbhA требует твердой поверхности для выражения, а 4521 и sde - нет (21). Таким образом, контраст между уровнями экспрессии этих генов может отражать различия в использовании ими восходящих белков-активаторов.

Продукт гена
sdeK необходим для развития плодового тела и спороношения.

Результаты анализа последовательности ДНК с клонированными фрагментами локуса sde локализовали сайт вставки Ω4408 в ORF sdeK , 96 п.н. ниже предполагаемого стартового кодона трансляции белка SdeK.Вторая ORF, обозначенная trcF , была идентифицирована выше гена sdeK в том, что, по-видимому, является расходящимся опероном. Вставка в ORF trcF не оказывает заметного влияния на развитие или споруляцию, что указывает на то, что продукт этого гена не требуется для формирования плодовых тел.

Клетки, несущие вставку Ω4408 или делецию 700 п.н. в sdeK , образуют рыхлые агрегаты, но эти агрегаты не могут уплотняться в видимые структуры в форме холмика.Кроме того, эти мутации в sdeK уменьшают количество спор и количество жизнеспособных спор примерно от 100 до 1000 раз. Таким образом, обе мутации вызывают сходные дефекты развития и споруляции. Когда копия гена sdeK дикого типа предоставляется на эктопическом участке, дефекты развития, вызванные мутацией Δ sdeK , могут быть дополнены, хотя формирование плодовых тел немного задерживается. Поскольку другие исследования показали, что экспрессия гена из сайта attB может быть существенно снижена по сравнению с экспрессией из нативных сайтов (8, 21), мы предполагаем, что эта задержка может быть связана с более низкими уровнями экспрессии sdeK из attB . .Эти данные предполагают, что дефекты развития и споруляции, наблюдаемые для мутанта с инсерцией Ω4408, связаны с инактивацией гена sdeK , что означает, что продукт sdeK необходим для нормального формирования плодовых тел.

С-конец SdeK имеет сходство с передающим доменом белков гистидинкиназы.

Когда мы провели поиск в базе данных GenBank на предмет сходства с предполагаемым продуктом гена sdeK , мы обнаружили, что C-концевые 228 аминокислоты SdeK имеют сходство с передающим доменом белков гистидинкиназы двухкомпонентных регуляторных систем.В двухкомпонентной парадигме компонент гистидинкиназы воспринимает определенный внутриклеточный или внеклеточный сигнал. В ответ на это изменение он аутофосфорилирует по консервативному остатку гистидина в домене трансмиттера. Затем фосфорильная группа может быть перенесена на остаток аспартата в принимающем домене компонента регулятора родственной реакции, модулируя его активность. Обычно регулятор ответа представляет собой ДНК-связывающий белок, который изменяет экспрессию гена. Таким образом, двухкомпонентные регуляторные системы позволяют клеткам отслеживать экологические и физиологические изменения и затем соответствующим образом реагировать.

Открытие того, что SdeK может быть цитоплазматической гистидинкиназой, имеет несколько значений. Во-первых, это предполагает, что SdeK может быть частью пути передачи сигнала. Нарушение гена sdeK блокирует развитие до образования холмика, указывая на то, что этот путь передачи сигнала необходим относительно рано в программе развития. Во-вторых, активность SdeK может модулироваться внутриклеточным сигналом или ассоциацией с мембраносвязанным компонентом, который воспринимает некоторые внеклеточные изменения.В-третьих, SdeK может распространять входной сигнал, изменяя активность регулятора ответа, позволяя этому белку изменять экспрессию генов развития или некоторые другие клеточные процессы. Поскольку копия локуса sde дикого типа необходима для онтогенетической экспрессии генов devRS (25), возникает соблазн предположить, что одной из потенциальных мишеней пути передачи сигнала SdeK является оперон devRS . Дальнейшее понимание функции предложенного пути передачи сигналов SdeK требует, чтобы мы идентифицировали входной сигнал для SdeK, его партнера-регулятора ответа и цель или цели регулятора ответа.

(PDF) SdeK, гистидинкиназа, необходимая для развития Myxococcus xanthus

hauge и Søgaard-Anderson исследовали, может ли составляющая

активная форма FruA (FruAD59E) обходить, а

, следовательно, подавлять фенотип ⌬SdeK1. . Фенотипически образующийся двойной мутант

(⌬SdeK1 FruAD59E) ведет себя как

родитель sdeK1 (E. Ellehauge и L. Søgaard-Anderson, личное сообщение

). Однако конститутивно активная форма

FruA дополняет дефекты развития и

споруляции мутантного штамма fruA (4).Эти результаты

показывают, что FruA не является регулятором родственной реакции SdeK

и что SdeK действует либо ниже по течению, либо независимо от

FruA, чтобы контролировать экспрессию онтогенетических генов.

Альтернативная модель утверждает, что пути SdeK и C-signal-

ing координируют экспрессию генов, воздействуя на гены

независимо от генов, экспрессируемых относительно рано в процессе развития (например, 4400 и devTRS). Отдельные пути передачи сигналов C и

SdeK могут впоследствии сливаться

с образованием единого пути, влияя, таким образом, на экспрессию субстанциально экспрессируемых генов

(например,g., 4403, ⍀4406 и ⍀4435) через общий нормативный компонент

. Существует косвенное свидетельство

оперона devTRS как возможного кандидата

для гена (ов), который кодирует этот общий фактор. Жюльен и др.

сообщили, что отмена экспрессии нескольких слияний

Tn5lac после того, как devTRS экспрессируется на фоне devTRS-null

(11).

Очевидно, что идентификация регулятора спонса SdeK родственного ре-

существенно поможет нашему пониманию

того, как путь передачи сигнала SdeK и путь передачи сигнала С-сигнала

координируют регуляцию экспрессии онтогенетического гена

в 6-8-часовой переход.Мы использовали множество биохимических подходов

в попытке идентифицировать регулятор спонса SdeK родственного re-

; однако эти подходы не увенчались успехом. В настоящее время используются генетические методы для идентификации этого гена

.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим М. Иго за подарок MBP-EnvZ и за советы по тестам фосфорилирования

и Э. Болдуина за совет по фиксации His-SdeK puri-

. Мы также благодарим Т.Полномочия на критическое чтение скрипта manu-

.

Эта работа была частично поддержана грантом Национального института здравоохранения

(GM54592) M.S.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кампос, Дж. М., Дж. Гейссельсодер и Д. Р. Зусман. 1978. Выделение бактериофага Mx4 териофага

, генерализованного трансдуцирующего фага Myxococcus xanthus.

J. Mol. Биол. 11: 167–178.

1а. Каллен П. Дж., У. К. Боуман и Р. Г. Кранц. 1996. Восстановление

in vitro и характеристика двухкомпонентной системы Rhodobacter capsulatus NtrB и NtrC.J. Biol. Chem. 271: 6530–6536.

2. Даунард Дж., С. В. Рамасвами и К.-С. Кил. 1993. Идентификация esg, генетического локуса

, участвующего в передаче сигналов между клетками во время развития Myxococcus xanthus de-

. J. Bacteriol. 175: 7762–7770.

3. Дворкин М. и Д. Кайзер. 1985. Клеточные взаимодействия в росте миксобактерий

и развитии. Наука 230: 18–24.

4. Ellehauge, E., M. Norregaard-Madsen и L. Søgaard-Andersen. 1998. Белок сигнальной трансдукции

FruA обеспечивает контрольную точку для временной координации

межклеточных сигналов в развитии Myxococcus xanthus.

Мол. Microbiol. 30: 807–817.

5. Гарза А. Г., Дж. С. Поллак, Б. З. Харрис, А. Ли, И. М. Кеселер, Э. Ф. Ликинг,

и М. Сингер. 1998. SdeK необходим для раннего развития плодовых тел.

Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 180: 4628–4637.

6. Хаген Д. К., А. П. Бретчер и Д. Кайзер. 1978. Синергизм между

морфогенетическими мутантами Myxococcus xanthus. Dev. Биол. 64: 284–296.

7. Хаген, Т. Дж., И Л. Дж. Шимкетс.1990. Нуклеотидная последовательность и продукты транскрипции

локуса csg Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 172: 15–23.

8. Ханахан, Д. 1983. Исследования трансформации Escherichia coli с плазмой

mids. J. Mol. Биол. 166: 557–560.

9. Хох, Дж. А. 2000. Двухкомпонентная и фосфорелейная передача сигнала.

Curr. Opin. Microbiol. 3: 165–170.

10. Хуанг К. Дж. И М. М. Иго. 1996. Идентификация оснований в регуляторной области ompF

, которые взаимодействуют с фактором транскрипции OmpR.J. Mol.

Биол. 262: 615–628.

11. Жюльен Б., Д. Кайзер и А. Гарза. 2000. Пространственный контроль клеточной дифференциации -

у Myxococcus xanthus. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 97: 9098–9103.

12. Kaiser, D. 1979. Социальное скольжение коррелирует с наличием пилей у

Myxococcus xanthus. Proc. Natl. Акад. Sci. США 76: 5952–5956.

13. Ким, С. К., и Д. Кайзер. 1990. C-фактор: сигнальный белок

, необходимый для морфогенеза плодовых тел Myxococcus xanthus.Cell 61:

19–26.

14. Kroos, L., and D. Kaiser. 1984. Конструирование Tn5lac, транспозона, который

сливает экспрессию lacZ с экзогенными промоторами, и его введение в

Myxococcus xanthus. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 81: 5816–5820.

15. Kroos, L., and D. Kaiser. 1987. Экспрессия многих онтогенетически регулируемых генов у Myxococcus зависит от последовательности клеточных взаимодействий. Гены

Дев. 1: 840–854.

16.Кроос, Л., А. Куспа и Д. Кайзер. 1986. Глобальный анализ развития

регулируемых генов Myxococcus xanthus. Dev. Биол. 117: 252–266.

17. Kroos, L., A. Kuspa, and D. Kaiser. 1990. Дефекты развития плодового тела -

, вызванные инсерциями Tn5 lac у Myxococcus xanthus. J. Bacteriol.

172: 484–487.

18. Kuner, J., and D. Kaiser. 1981. Введение транспозона Tn5 в кокк Myxo-

для анализа онтогенетических и других неизбираемых мутантов.Proc.

Нац. Акад. Sci. США 78: 425–429.

19. Куспа А. 1986. Ph.D. Тезис. Кафедра биохимии Стэнфордского университета

Медицинская школа Университета, Стэнфорд, Калифорния

20. Куспа А., Л. Кроос и Д. Кайзер. 1986. Межклеточная передача сигналов необходима

для экспрессии генов развития у Myxococcus xanthus. Dev. Биол. 117:

267–276.

21. Куспа А., Л. Пламанн и Д. Кайзер. 1992. Идентификация термостабильного А-фактора

из Myxococcus xanthus.J. Bacteriol. 174: 3319–3326.

22. Ли, К., и Л. Дж. Шимкетс. 1994. Клонирование и характеристика локуса socA

, который восстанавливает развитие Myxococcus xanthus C-signaling mu-

тантов. J. Bacteriol. 176: 2200–2209.

23. Ли, С.-Ф., Б. Ли, и Л. Дж. Шимкетс. 1992. Экспрессия CsgA вовлекает развитие Myxo-

coccus xanthus. Genes Dev. 6: 401–410.

24. Мартин С., Т. Содергрен, Т. Мауда и Д. Кайзер. 1978. Систематическая изоляция

фагов, трансдуцирующих Myxococcus xanthus.Вирусология 88: 44–53.

25. Мартсон, Ф. А. О. и Д. Л. Хартли. 1990. Солюбилизация белковых агрегатов

гейт. Методы Энзимол. 182: 264–276.

26. Огава, М., С. Фудзитани, X. Х. Мао, С. Иноуэ и Т. Комано. 1996. FruA,

предполагаемый фактор транскрипции, необходимый для развития Myxococcus

xanthus. Мол. Microbiol. 22: 757–767.

27. Parkinson, J. K., and E.C. Kofoid. 1992. Коммуникационные модули в бактериальных сигнальных белках.Анну. Преподобный Жене. 26: 71–112.

28. Plamann, L., A. Kuspa, and D. Kaiser. 1992. Белки, которые спасают A-сигнал -

дефектных мутантов Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 174: 3311–3318.

29. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство

, 2-е изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, N.Y.

30. Shimkets, L. J., and D. Kaiser. 1982. Индукция согласованного движения

клеток Myxococcus xanthus.J. Bacteriol. 152: 451–461.

31. Сингер М. и Д. Кайзер. 1995. Эктопическая продукция гуанозина пента- и тетрафосфата

может инициировать экспрессию генов раннего развития у Myxo-

coccus xanthus. Genes Dev. 9: 1633–1644.

32. Søgaard-Andersen, L., and D. Kaiser. 1996. Фактор C, ассоциированный с клеточной поверхностью межклеточный сигнальный белок

, стимулирует систему передачи сигнала Frz

в Myxococcus xanthus. Proc. Natl. Акад.Sci. USA 93: 2675–2679.

33. Спратт Б. Г., П. Дж. Хедж, С. Т. Хеесен, А. Эдельман и Дж. К. Брум -

Смит. 1986. Устойчивые к канамицину векторы, являющиеся аналогами плазмид pUC8,

,

pUC9, pEMBL8 и pEMBL9. Gene 41: 337–342.

34. Тонны-Мейер, Л. и Д. Кайзер. 1993. devRS, ауторегулируемый и важный генетический локус

для развития плодовых тел Myxococcus xanthus. J. Bac-

териол. 175: 7450–7462.

3596 ПОЛЛАК И ПЕВИЦА J.БАКТЕРИОЛ.

(PDF) SdeK необходим для развития плодовых тел у Myxococcus xanthus

Спаривание

немного задержалось. Поскольку другие исследования обнаружили

, что экспрессия гена из сайта attB может быть существенно снижена на

по сравнению с экспрессией из нативных сайтов (8, 21), мы,

, предполагаем, что эта задержка может быть связана с более низкими уровнями экспрессии sdeK

из attB. Эти открытия предполагают, что дефекты в развитии и споруляции

, наблюдаемые для мутанта

со вставкой V4408, связаны с инактивацией гена sdeK, подразумевая

, что продукт sdeK необходим для образования нормального плодового тела

.

С-конец SdeK имеет сходство с доменом трансмиттера

белков гистидинкиназы. Когда мы провели поиск в базе данных

GenBank на предмет сходства с предполагаемым продуктом

гена sdeK, мы обнаружили, что C-концевые 228 аминокислоты

SdeK имеют сходство с передающим доменом киназных белков гистидина

, состоящего из двух частей. составные системы регулирования. В двухкомпонентной модели

компонент гистидинкиназы

воспринимает специфический внутриклеточный или внеклеточный сигнал.В ответ на это изменение

он аутофосфорилирует по консервативному остатку гистидина

в передающем домене. Рильная группа фосфо-

затем может быть перенесена на остаток аспартата в пределах

рецепторного домена родственного компонента регулятора ответа

, модулируя его активность. Обычно регулятор ответа

представляет собой ДНК-связывающий белок, изменяющий экспрессию гена. Таким образом, двухкомпонентные регуляторные системы

позволяют клеткам отслеживать изменения окружающей среды и физиологические изменения, а затем соответственно реагировать на них.

Открытие того, что SdeK может быть цитоплазматической гистидинкиназой

, имеет несколько значений. Во-первых, это предполагает, что SdeK может быть

частью пути передачи сигнала. Нарушение гена sdeK

блокирует развитие до образования холмика, указывая на

, что этот путь передачи сигнала необходим относительно рано

в программе развития. Во-вторых, активность SdeK

может модулироваться внутриклеточным сигналом или ассоциацией

с мембранно-связанным компонентом, который воспринимает некоторые внеклеточные изменения.В-третьих, SdeK может распространять входной сигнал посредством

, изменяя активность регулятора ответа, позволяя этому протеину pro-

изменять экспрессию онтогенетического гена или какой-либо другой клеточный процесс

. Поскольку копия локуса sde дикого типа

необходима для онтогенетической экспрессии генов devRS (25),

, возникает соблазн предположить, что одной из потенциальных мишеней пути передачи сигнала SdeK

является оперон devRS. Дальнейшее понимание функции предложенного пути передачи сигналов

SdeK требует, чтобы мы идентифицировали входной сигнал для SdeK, его партнера-регулятора ответа

и цель или цели регулятора ответа

.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Пегги Бэр и Джоди Нуннари за полезные обсуждения и

за критическое прочтение рукописи. Кроме того, мы благодарим Stacia

Hoover и Dean Lavell за техническую помощь с секвенированием и

за предоставление компьютерного программного обеспечения.

Эта работа была поддержана (частично) стипендией Национального института здравоохранения

(GM19080) для постдокторантуры A.G.G. и грант Национального института здоровья

(GM54592) М.S.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Anthamatten, D., and H. Hennecke. 1991. Регуляторный статус генов fixL-

и fixJ-подобных генов у Bradyrhizobium japonicum может отличаться от Rhi-

zobium meliloti. Мол. Genet Genet. 225: 38–48.

2. Антоневски К., Б. Савелли и П. Стражье. 1990. Ген spoIIJ, который

регулирует ранние стадии развития Bacillus subtilis, принадлежит к классу

экологически чувствительных генов. J. Bacteriol.172: 86–93.

3. Бибб М. Дж., П. Р. Финдли и М. В. Джонсон. 1984. Связь

между составом оснований и использованием кодонов в бактериальных генах и ее использование для

простой и надежной идентификации последовательностей, кодирующих белок. Ген 30:

157–166.

4. Бланко Г., М. Драммонд, П. Вудли и К. Кеннеди. 1993. Последовательность

и молекулярный анализ гена nifL Azotobacter vinelandii. Мол.

Microbiol. 9: 869–879.

5. Дэвид М., М. Л. Даверан, Дж. Батут, А. Дедье, О. Домерг, Дж. Гай и

К. Хертиг. 1988. Каскадная регуляция экспрессии гена nif в Rhizobium

meliloti. Cell 54: 671–683.

6. Даунард Дж., С. В. Рамасвами, К.-С. Кил. 1993. Идентификация esg, генетического локуса

, участвующего в передаче сигналов между клетками во время развития Myxococcus xanthus de-

. J. Bacteriol. 175: 7762–7770.

7. Дрейпер Д. Э. 1996. Инициирование перевода, стр.902–908. В FC Neidhardt, R.

Curtiss III, JL Ingraham, ECC Lin, KB Low, B. Magasanik, WS

Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter и HE Umbarger (ed.), Escherichia

coli и Сальмонелла: клеточная и молекулярная биология, 2-е изд., Т. 1. Американское общество микробиологии

, Вашингтон, округ Колумбия

8. Фиссеха М., М. Глодеманс, Р. Э. Гилл и Л. Кроос. 1996. Характеристика регуляторной области гена, зависимого от клеточного взаимодействия, у Myxo-

coccus xanthus.J. Bacteriol. 178: 2539–2550.

9. Гилл Р. Э., М. Г. Калл и С. Флай. 1988. Таким образом, генетическая идентификация и клонирование

гена, необходимого для взаимодействия онтогенетических клеток у Myxococcus xan-

. J. Bacteriol. 170: 5279–5288.

10. Хаген Д. К., А. П. Бретчер и Д. Кайзер. 1978. Синергизм между

морфогенетическими мутантами Myxococcus xanthus. Dev. Биол. 64: 284–296.

11. Ханахан, Д. 1983. Исследования трансформации Escherichia coli с плазмой

mids.J. Mol. Биол. 166: 557.

12. Харрис Б. З., Д. Кайзер и М. Сингер. 1998. Нуклеотид гуанозина

(p) ppGpp инициирует развитие и продукцию A-фактора у Myxococcus

xanthus. 12: 1022–1035.

13. Хеннер, Д. Дж., М. Янг и Э. Феррари. 1988. Локализация мутации Bacillus subtilis

sacU (Hy) в двух сцепленных генах, имеющих сходство с консервативным прокариотическим семейством

двухкомпонентных сигнальных систем. J. Bacteriol. 170:

5102–5109.

14. Hodgkin, J., and D. Kaiser. 1977. Стимуляция движения от клетки к клетке у

неподвижных мутантов Myxococcus. Proc. Natl. Акад. Sci. США 74: 2938–2942.

15. Джонс, К. А., К. Р. Ямамото, Р. Тьян. 1985. Два различных фактора транскрипции

связывают промотор тимидинкиназы HSV in vitro. Ячейка 42: 559–572.

16. Жюльен, Б. и Д. Кайзер. Личное общение.

17. Кайзер Д. 1986. Контроль многоклеточного развития: Dictyostelium и

Myxococcus.Анну. Преподобный Жене. 20: 539–566.

18. Kaiser, D., and R. Losick. 1993. Как и почему бактерии разговаривают друг с другом.

Cell 73: 873–885.

19. Kalman, L. V., Y. L. Cheng, and D. Kaiser. 1994. Продукт гена Myxococcus xanthus

dsg выполняет функции фактора инициации трансляции IF3 в

vivo. J. Bacteriol. 176: 1434–1442.

20. Каплан, Х. Б., А. Куспа, Д. Кайзер. 1991. Таким образом, супрессоры, которые позволяют

A-независимую от сигнала экспрессию гена развития в Myxococcus xan-

.J. Bacteriol. 173: 1460–1470.

21. Кеселер, И. М., и Д. Кайзер. 1995. Ранний зависимый от A-сигнала ген в

Myxococcus xanthus имеет промотор, подобный s

54

. J. Bacteriol. 177: 4638–4644.

22. Kroos, L., and D. Kaiser. 1984. Конструирование Tn5lac, транспозона, который

сливает экспрессию lacZ с экзогенными промоторами, и его введение в

Myxococcus xanthus. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 81: 5816–5820.

23. Кроос, Л., и Д. Кайзер. 1987. Экспрессия многих онтогенетически регулируемых генов у Myxococcus зависит от последовательности клеточных взаимодействий. Гены

Дев. 1: 840–854.

24. Kroos, L., A. Kuspa, and D. Kaiser. 1986. Глобальный анализ развития

регулируемых генов Myxococcus xanthus. Dev. Биол. 117: 252–266.

25. Kroos, L., A. Kuspa, and D. Kaiser. 1990. Дефекты развития плодового тела -

, вызванные инсерциями Tn5 lac у Myxococcus xanthus.J. Bacteriol. 172:

484–487.

26. Кунст, Ф., М. Дебарбуй, Т. Мсадек, М. Янг, К. Мауэль, Д. Карамата,

А. Клиер, Г. Рапопорт и Р. Дедондер. 1988. Выведенные полипептиды en-

, кодируемые локусом Bacillus subtilis sacU, имеют гомологию с двухкомпонентными системами сенсор-регулятор

. J. Bacteriol. 170: 5093–5101.

27. Куспа А., Л. Кроос и Д. Кайзер. 1986. Межклеточная передача сигналов необходима

для экспрессии генов развития у Myxococcus xanthus.Dev. Биол. 117:

267–276.

28. Куспа А., Л. Пламанн и Д. Кайзер. 1992. Идентификация термостабильного А-фактора

из Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 174: 3319–3326.

29. ЛаРосса Р., Дж. Кунер, Д. Хаген, К. Манойл и Д. Кайзер. 1983. Devel-

Опментальные клеточные взаимодействия Myxococcus xanthus: анализ мутантов.

J. Bacteriol. 153: 1394–1404.

30. Макино К., Х. Синагава, М. Амемура и А. Наката. 1986. Нуклеотидная последовательность

гена phoR, регуляторного гена фосфатного регулона

Escherichia coli.J. Mol. Биол. 192: 549–546.

31. Manoil, C., and D. Kaiser. 1980. Накопление гуанозинтетрафосфата

и гуанозинпентафосфата в Myxococcus xanthus во время голодания и образование миксоспор

. J. Bacteriol. 141: 297–304.

32. Манойл К. и Д. Кайзер. 1980. Гуанозин пентафосфат и гуанозин

Накопление тетрафосфата и индукция плодоношения Myxococcus xanthus

развитие тела. J. Bacteriol. 141: 305–315.

33.Манойл, К. С. 1982. Доктор философии. Тезис. Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния,

34. Мессинг Дж., Б. Гроненборн, Б. Мюллер-Хилл и П. Хопшнайдер. 1977.

Нитчатый колифаг M13 в качестве носителя для клонирования: вставка фрагмента HindII -

регуляторной области lac в репликативную форму M13 in vitro. Proc. Natl.

Акад. Sci. США 74: 3642–3646.

35. Миранда-Риос, Дж., Р. Санчес-Пескадор, М. Урдя и А. А. Коваррубиас.

4636 GARZA ET AL.J. BACTERIOL.

Захват системной трассировки на устройстве | Разработчики Android

Устройства под управлением Android 9 (уровень API 28) или выше включают приложение системного уровня. называется системной трассировкой. Это приложение похоже на systrace утилита командной строки, но приложение позволяет записывать трассировки непосредственно с самого тестового устройства, без необходимо подключить устройство и подключиться к нему через ADB. Затем вы можете использовать приложение, чтобы поделиться результатами этих трассировок с вашей командой разработчиков.

Особенно полезно записывать трассировки при решении проблем, связанных с производительностью. ошибки в вашем приложении, такие как медленный запуск, медленные переходы или несоответствие пользовательского интерфейса.

Запись системной трассировки

Приложение System Tracing позволяет записывать системную трассировку с помощью Quick Плитка настроек или меню в самом приложении. В следующих разделах описывается как завершить процесс записи с помощью этих интерфейсов.

Примечание: В рамках рабочего процесса разработки вы можете сообщить об ошибке на устройстве. отчет.Важно подать отчет об ошибке после того, как вы закончите . запись системной трассировки. Таким образом, сам процесс сообщения об ошибке не включается. в записанной трассе.

Запись с использованием плитки быстрых настроек

Плитка быстрых настроек обычно более удобный способ завершить процесс отслеживания системы на устройстве.

Настроить плитку
Рис. 2. Плитка Показать быстрые настройки Переключатель в приложении System Tracing

Если вы впервые используете Системную трассировку на своем тестовом устройстве, или если вы не видеть плитку Системная трассировка на панели быстрых настроек вашего устройства (Рисунок 1), выполните следующие шаги настройки:

  1. Включите параметры разработчика, если вы не сделали этого сделал это уже.
  2. Откройте экран настроек Developer Options .
  3. В разделе Отладка выберите Системная трассировка . Системная трассировка приложение открывается, показывая меню приложения.
  4. В меню приложения включите Показать плитку быстрых настроек , как показано на рисунке 2. Система добавляет плитку System Tracing на панель быстрых настроек , который показан на рисунке 1:

    Рис. 1. Плитка System Tracing внутри Панель быстрых настроек

    Примечание: По умолчанию система добавляет плитку System Tracing в качестве первой плитки в Quick Панель настроек .Если вы хотите, чтобы плитка отображалась в другом положение, используйте режим редактирования панели, чтобы переместить плитку.

Завершить запись трассировки системы

Чтобы записать системную трассировку с помощью панели быстрых настроек , выполните следующие шаги:

  1. Коснитесь плитки Системная трассировка с меткой «Запись трассировки». Плитка становится включенным, и появляется постоянное уведомление о том, что теперь система записывает трассировку, как показано на Рисунке 3:

    Рисунок 3. Постоянное уведомление, которое появляется после запуск системной трассировки на устройстве
  2. Выполните в приложении действия, которые должна проверять система.

    Примечание: Вы можете записывать ошибки, которые трудно воспроизвести, выйдя из системы. Трассировка выполняется в фоновом режиме, а затем прекращается трассировка системы. после появления ошибки. Системная трассировка сохраняет активность устройства в непрерывном режиме. буфер, в котором хранятся события продолжительностью 10–30 секунд.
  3. По завершении этих действий прекратите отслеживание, нажав на значок Системная трассировка Плитка на панели быстрых настроек или в Системной трассировке уведомление.

    Система отображает новое уведомление, которое содержит сообщение «Сохранение трассировка ". По окончании сохранения система закрывает уведомление. и отображает третье уведомление, подтверждающее, что ваш след был сохранен и что вы готовы поделиться системной трассировкой, как показано на Рисунок 4:

    Рисунок 4. Постоянное уведомление, которое появляется после система завершила сохранение записанной трассы

Меню приложения позволяет настроить несколько дополнительных параметров, относящихся к системе. трассировка и предоставляет переключатель для запуска и остановки системной трассировки.

Чтобы записать системную трассировку с помощью меню приложения System Tracing, выполните следующие шаги:

  1. Включите параметры разработчика, если вы не сделали этого сделал это уже.
  2. Откройте экран настроек Developer Options . В разделе Отладка , выберите System Tracing . Откроется приложение System Tracing.

    В качестве альтернативы, если вы настроили плитку System Tracing , вы можете долго нажимать на плитку, чтобы войти в приложение System Tracing.

  3. Убедитесь, что Trace debuggable applications выбран для включения приложения, для которых включена отладка в системной трассировке.

  4. Дополнительно, выберите Категории системных и сенсорных вызовов для отслеживания, и выберите размер буфера на процессор (в КБ). Выберите категории, соответствующие вариант использования, который вы тестируете, например, категория Audio для тестирования Операции Bluetooth или категория Память для распределения кучи.

    Примечание: Эти категории служат настройками на уровне приложения, поэтому система использует их категории при использовании плитки быстрых настроек . Кроме того, эти настройки сохраняются при перезагрузке устройства. Рисунок 5. Переключатель Record Trace в Системе Приложение для розыска
  5. Дополнительно выберите Длинные трассы , чтобы трассировки сохранялись непрерывно. в память устройства. Для этого варианта необходимо установить пределы для максимального значения . размер длинной трассы и Максимальная длительность длинной трассы .

  6. Включите переключатель Record trace , выделенный на рисунке 5. Плитка станет включен, и появляется постоянное уведомление о том, что система теперь записываем трассу (рисунок 3).

  7. Выполните в приложении действия, которые должна проверять система.

    Примечание: Вы можете записывать ошибки, которые трудно воспроизвести, выйдя из системы. Трассировка выполняется в фоновом режиме, а затем прекращается трассировка системы. после появления ошибки.По умолчанию System Tracing сохраняет активность устройства в буфер, в котором хранятся события продолжительностью 10–30 секунд. Если у вас Long трассировка включена, активность устройства постоянно сохраняется на устройство хранилище до установленных вами лимитов.
  8. После выполнения этих действий прекратите отслеживание, отключив запись Переключатель трассировки .

    Система отображает новое уведомление, которое содержит сообщение «Сохранение трассировка ". По окончании сохранения система закрывает уведомление. и отображает третье уведомление, подтверждающее, что ваш след был сохранен и что вы готовы поделиться системной трассировкой, как показано на Рисунок 4.

Поделиться системной трассировкой

Приложение System Tracing помогает обмениваться результатами системной трассировки в рамках нескольких разные рабочие процессы. На устройстве под управлением Android 10 (уровень API 29) или более поздней версии файлы трассировки сохраняются с расширением имени файла .perfetto-trace и могут быть открыт в пользовательском интерфейсе Perfetto. На устройства под управлением более ранней версии Android файлы трассировки сохраняются с .ctrace расширение имени файла, которое обозначает формат Systrace.

Поделиться сообщением

System Tracing позволяет вам делиться собранной трассировкой с другими приложениями на вашем устройство.При этом вы можете отправить трассировку своей команде разработчиков через электронной почты или приложения для отслеживания ошибок без необходимости подключения устройства к вашему машина разработки.

После того, как вы записали системную трассировку, нажмите на уведомление, которое появляется на устройство (см. рисунок 4). Средство выбора намерений платформы появляется, позволяя вам поделиться своим следом с помощью приложения для обмена сообщениями вашего выбор.

Поделиться из приложения "Файлы"

На устройствах под управлением Android 10 (уровень API 29) трассировки отображаются в приложении «Файлы».При желании вы можете поделиться следом из этого приложения.

Скачать отчет с помощью ADB

При желании можно также извлечь системную трассировку с устройства с помощью ADB. Соединять устройство, которое записало трассировку на вашу машину разработки, затем запустите следующие команды в окне терминала:

cd /  путь к трассировке на моей машине разработки  && \
  adb pull / data / local / traces /. 

Преобразование между форматами трассировки

Вы можете конвертировать файлы трассировки Perfetto в формат Systrace.Видеть Преобразование между форматами трассировки для дополнительной информации.

Создание отчета в формате HTML

При публикации вашего следа сам отчет находится в файле .perfetto-trace (на устройствах под управлением Android 10 или выше) или файл .ctrace (для всех других версий).

Создайте отчет HTML из файла трассировки с помощью веб-интерфейса или из командной строки.

Веб-интерфейс

Используйте Perfetto UI, чтобы открыть файл трассировки и сгенерируйте отчет.

Для файла Perfetto щелкните Открыть файл трассировки . Для файла Systrace щелкните Открыть с устаревшим интерфейсом . Устаревший пользовательский интерфейс выглядит так же, как и Отчет Systrace .

Командная строка

Выполните следующие команды в окне терминала для создания отчета HTML. из файла трассировки:

cd /  путь к трассировке на моей машине разработки  && \
  systrace --from-file  имя-файла-трассировки  {.ctrace | .perfetto-trace} 

Если у вас еще нет программы командной строки systrace , вы можете загрузить это из катапульты проект на GitHub или прямо из Android Open Source Проект.

Анализ энхансеров перидермы рыбок данио облегчает идентификацию регуляторного варианта, близкого к человеческому KRT8 / 18

Здесь мы предприняли анализ энхансеров перидермы рыбок данио с двумя целями, имеющими отношение к генетическим основам орофациального расщепления. Первым было узнать больше о генной регуляторной сети (GRN), управляющей дифференцировкой перидермы. Уже сейчас человеческие ортологи четырех известных элементов этого GRN, Irf6, Grhl3, Klf17 и простых кератинов эпителия вовлечены в риск несиндромального орофациального расщепления.Следовательно, ортологи дополнительных членов этой GRN, в частности гены в хабах сети, являются кандидатами на то, чтобы нести мутации, которые составляют недостающую наследуемость для орофациального расщепления. Вторая цель заключалась в использовании энхансеров перидермы рыбок данио для обучения классификатора, с помощью которого можно было бы расставлять приоритеты SNP в некодирующей ДНК с учетом их вероятности нарушения энхансеров перидермы. До недавнего времени идентификация энхансеров с заданной специфичностью требовала индивидуального тестирования энхансеров в репортерных анализах.Хроматиновая метка ChIP-seq и ATAC-seq, для которых требуется меньше клеток, позволили идентифицировать кандидаты в энхансеры в определенных тканях или типах клеток в большом количестве (Quillien et al., 2017; Wilkerson et al., 2019). Однако в настоящее время не существует модели клеточной линии перидермы неба человека. Клетки перидермы могут быть выделены из нёбных полок эмбрионов мышей с использованием клеточной сортировки, активируемой флуоресценцией (FACS), и линии трансгенных мышей Krt17 -GFP (McGowan and Coulombe, 1998). Однако перидерма рыбок данио гораздо более доступна.В то время как тканеспецифические энхансеры редко бывают сильно консервативными у рыб и млекопитающих, достоверная эффективность тканеспецифических энхансеров рядом с человеческим геном RET в анализах трансгенных репортеров рыбок данио подразумевает, что, по крайней мере в некоторых случаях, энхансеры, специфичные для данной ткани, являются состоят из одних и тех же сайтов связывания факторов транскрипции в двух кладах (Fisher et al., 2006a). В конечном итоге мы достигли обеих этих целей.

Для идентификации набора энхансеров, активных в перидерме рыбок данио, мы отсортировали GFP-положительные и GFP-отрицательные клетки из Tg (krt4: gfp) трансгенных эмбрионов через 11 часов после оплодотворения и выполнили ATAC-seq для обеих популяций.Около 5% всех ATAC-seq-положительных элементов имели как минимум в 2 раза больше считываний ATAC-seq в GFP-положительных клетках. Для сравнения: ATAC-seq на GFP-положительных и GFP-отрицательных клетках, отсортированных из Tg (fli1: gfp), эмбрионов рыбок данио через 24 часа после оплодотворения (Quillien et al., 2017), или просенсорных клеток, отсортированных из протоков улитки в году. Трансгенные мыши sox2-EGFP (Wilkerson et al., 2019) выявили, что около 9% и 15%, соответственно, всех элементов ATAC-seq имеют большую глубину считывания в GFP-положительных клетках. Различие в доле тканеспецифичных элементов может просто отражать различия в фильтре кратного изменения в чтениях-последовательностях ATAC, применяемом к таким элементам.Менее половины NFR, обогащенных GFP-положительными клетками, были помечены h4K27Ac в лизатах целых эмбрионов примерно на той же стадии (Bogdanovic et al., 2012). Это наблюдение согласуется с другими исследованиями, показывающими, что корреляция между статусом отсутствия нуклеосом и сигналом h4K27Ac не является абсолютной; например, неактивные энхансеры могут быть без нуклеосом (Iwafuchi-Doi et al., 2016). Гены, фланкирующие элементы, отвечающие обоим критериям, сильно обогащены теми, которые экспрессируются в перидерме. Гены, фланкирующие элементы, удовлетворяющие только первому критерию (больше считываний ATAC-seq в GFP-положительных клетках, чем в GFP-отрицательных клетках), были обогащены аналогичным образом, но в меньшей степени.Periderm-специфические NFR, лишенные h4K27Ac на 8hpf или 24 hpf, но связанные с генами, экспрессируемыми в перидерме, могут быть энхансерами, которые активны на другой стадии; в соответствии с существованием таких элементов, недавнее исследование показывает, что профиль экспрессии в перидерме рыбок данио изменяется со временем (Cokus et al., 2019). Кроме того, 10 из 10 протестированных элементов, отвечающих обоим критериям и проксимальных к генам, о которых известно, что они высоко и специфически экспрессируются в перидерме, функционировали как энхансеры перидермы в анализах репортеров рыбок данио.Вместе эти результаты подтверждают наш вывод о том, что элементы с большим количеством считываний ATAC-seq в GFP-положительных по сравнению с GFP-отрицательными клетками отсортированы из Tg (krt4: gfp) эмбрионов через 11 часов оплодотворения и помечены h4K27Ac через 8 часов оплодотворения и / или 24 часов оплодотворения. , обладают активностью энхансера (или промотора) перидермы у эмбрионов на этих стадиях.

Оценка сайтов связывания транскрипционных факторов, обогащенных пиками ATAC-seq, может дать представление о сетях регуляции транскрипции (Lowe et al., 2019; Miraldi et al., 2019), и это сделано здесь для перидермальной GRN.Во-первых, факторы транскрипции, которые, как известно, связывают мотивы, обогащенные кандидатами в энхансеры перидермы рыбок данио, включают те, которые ранее участвовали в развитии перидермы, такие как Irf6, Grhl3 и Klf17, и новые, включая C / ebp, Fosl, Gata3 и Tead. Интересно, что ортологи (или, в случае Klf17, паралог, Klf4) каждого из этих факторов транскрипции необходимы для развития кожи млекопитающих, показывая сходство соответствующих GRN (например, GRHL [Gordon et al., 2014; Nishino et al. др., 2017], TEAD-YAP (Elbediwy et al., 2016), FOS-JUN / AP-1 (Uluçkan et al., 2015), KLF4 (Segre et al., 1999), TFAP2 (Leask et al., 1991), GATA6 (Yang et al., 2002), C / EBP (Sato et al., 2012), ETS1 (Chin et al., 2013; Nagarajan et al., 2010), IRF6 [Ingraham et al., 2006]). Роль членов семейства Tead в развитии перидермы подтверждается наблюдением, что мутация потери функции в yap , кодирующая кофактор Tead, нарушает развитие перидермы в medaka (Porazinski et al., 2015). Знание ключевых элементов GRN перидермы может помочь в определении приоритетов вариантов, которые обнаруживаются у пациентов с орофациальным расщеплением при анализе всего экзома или всего генома.Во-вторых, в то время как сайты Irf6 обнаруживаются только у 5% кандидатов в энхансеры, сайты Grhl присутствуют в большинстве. Это означает, что хотя оба эти семейства факторов транскрипции важны для развития перидермы, белки Grhl функционируют гораздо шире, чем их аналоги Irf6. В-третьих, сайт связывания Irf6 был в большей степени обогащен кандидатами в энхансеры, которые были связаны с большим количеством считываний ChIP-seq анти-h4K27Ac через 8 часов после оплодотворения (hpf), чем через 11 часов после оплодотворения. Это означает, что Irf6 действует на ранней стадии GRN; представление о том, что Irf6 активирует программу перидермы и в этом случае больше нет необходимости, согласуется с тем фактом, что мутанты zygotic irf6 являются жизнеспособными (Li et al., 2017). Наконец, zGPAE, связанные с генами, кодирующими кандидаты в члены GRN, содержат сайты связывания для других таких членов, подразумевая, что взаимная перекрестная регуляция этих факторов транскрипции является обширной. В то время как прямые связи, выведенные таким образом, ждут подтверждения с помощью ChIP-seq или CUT & RUN, перекрестная регуляция между членами данного слоя GRN является общей чертой в разработке (Davidson, 2009). Следует отметить, что данные ATAC-seq могут быть объединены с данными RNA-seq для получения моделей сетей регуляции транскрипции, которые приближаются к более сложным сетевым моделям, полученным с помощью исследований ChIP-seq и нокаута транскрипционных факторов (Miraldi et al., 2019).

Затем мы применили классификатор машинного обучения к кандидатам в энхансеры перидермы рыбок данио и использовали его для проверки предсказания, что энхансеры перидермы рыбок данио обогащены теми же мотивами последовательностей, что и их аналоги из млекопитающих. В то время как машинный классификатор опорных векторов с пробелами был самым эффективным алгоритмом на момент начала исследования, сейчас доступны другие, которые могут работать лучше в некоторых обстоятельствах (Liu et al., 2017b). Обученный классификатор имел низкую частоту ложных срабатываний и кривые auROC и auPR, сопоставимые с таковыми в аналогичных опубликованных исследованиях (Gorkin et al., 2012; Chen et al., 2018). Мы применили gkmSVM к тайлам генома рыбок данио. Построение среднего балла плиток, перекрывающих обучающий набор, и тех, которые не перекрывают, было полезно для передачи потенциала этого инструмента для различения усилителей перидермы на основе одной только последовательности. В среднем плитки, перекрывающие биохимически предсказанные усилители перидермы (т. Е. ZGPAE), имеют более высокие баллы, чем те, которые этого не делают, но графики этих двух распределений перекрываются, что указывает на то, что высокий балл не является гарантией того, что элемент является усилителем перидермы.Мы также применили классификатор к геному человека и обнаружили, что энхансеры в различных типах эпителиальных клеток обогащены для плиток с высокими показателями больше, чем энхансеры других классов. Это предполагает, что эпителиальные энхансеры сконструированы аналогичным образом у этих позвоночных организмов. В некоторых случаях плитки с высокими показателями в геноме человека могут быть ортологами энхансеров перидермы рыбок данио. Примером такого случая может быть плитка с высокими показателями в 8,3 т.п.н. выше гена PPL человека, который, как мы обнаружили, имел детектируемую консервацию последовательности по отношению к GFP-положительному NFR на 10 т.п.н. выше гена ppl рыбок данио.Применение классификатора к геному мышей показало, что плитки с высокими показателями были обогащены рядом с генами, экспрессируемыми в перидерме, показывая, что энхансеры перидермы у рыбок данио и мышей обогащены по одним и тем же мотивам последовательности. Это означает, что энхансеры перидермы человека разделяют эту особенность и поддерживает использование классификатора в анализе deltaSVM ассоциированных с заболеванием SNP рядом с генами, экспрессируемыми в перидерме.

Наконец, мы использовали классификатор, обученный на zGPAE, для определения приоритета SNP, связанных с орофациальной щелью, около KRT18, гена, экспрессируемого в перидерме, для тех, которые могут влиять на энхансер перидермы.Интересно, что классификаторы, обученные энхансерам, очевидно, селективны для а) перидермы рыбок данио по сравнению с неперидермой, б) эпителия неба мыши по сравнению с мезенхимой неба или в) линии клеток эпителия полости рта человека по сравнению с линией клеток мезенхимы неба человека, все выбранные SNP2 (т. Е. Rs2070875 ) как имеющий самый сильный Delta SVM среди 14 OFC-ассоциированных SNP в этом локусе. Это снова подтверждает представление о том, что эпителиальные энхансеры устроены сходным образом у всех позвоночных. Хотя наборы сайтов связывания обогащенных транскрипционных факторов, обогащенные тремя наборами энхансеров, были сходными, только классификатор, обученный на энхансерах перидермы рыбок данио, дал deltaSVM для SNP2, который соответствовал формальной значимости.Предполагая, что SNP2 действительно функционален, эти результаты показывают, что успех deltaSVM в идентификации функциональных SNP больше зависит от энхансеров, полученных из правильной ткани (т.е. перидермы), чем от правильного вида (т.е. человека).

Является ли SNP2 ассоциированным с орофациальной щелью (OFC) SNP в этом локусе, который непосредственно влияет на риск заболевания? Люциферазные анализы в клетках эпителия ротовой полости человека подтверждают представление о том, что SNP1 и SNP2 находятся в энхансерах, активных в эпителии ротовой полости, и подтверждают предсказания анализа deltaSVM о том, что SNP2, но не SNP1, влияет на активность энхансера, охватывающего их.Тот факт, что гомозиготная делеция области 109 п.н., фланкирующей SNP2, снижает экспрессию KRT18 и KRT8, , также поддерживает SNP2, влияющий на риск OFC, поскольку целостность перидермы нарушена у эмбрионов рыбок данио, лишенных нескольких генов кератина (Pei et al., 2007) . Неожиданно эти элементы не были постоянно активными в репортерных анализах, проводимых на эмбрионах рыбок данио и мышей. Однако надежные данные о хроматиновых метках на человеческих эмбриональных лицах и человеческих эпидермальных кератиноцитах предполагают, что отсутствие усиливающей активности этих элементов в анализах на эмбрионах рыбок данио и мышей отражает технический артефакт; например, возможно, что эти энхансеры несовместимы с базальным промотором в векторе GFP (из гена FOS Fisher et al., 2006b) или в векторе LacZ (из гена Shh ). В анализах репортеров эмбрионов рыбок данио энхансеры работают более надежно в сочетании со своими родственными промоторами, чем с экзогенными (Quillien et al., 2017). Интересно, что у одного эмбриона мыши с 8 копиями конструкции трансгена SNP2 экспрессия репортера четко выявлялась во внешней перидерме. Конструкция имела аллель риска SNP2, но поскольку количество репортерных копий варьировалось среди эмбрионов, мы не могли оценить, влияет ли аллель на уровень репортера в этом анализе.Создание эмбрионов с множеством интегрированных копий конструкций или, возможно, нацеливание конструкций на другой локус, будет необходимо для определения активности энхансера, несущего SNP2, в перидерме полости рта, как можно было бы предсказать, если SNP2 имеет отношение к риску орофациального расщепления. Таким образом, собранные данные подтверждают, что SNP2 влияет на экспрессию энхансера, активного в перидерме, и регулирует экспрессию KRT18 и KRT8 .

В заключение мы предполагаем, что представленные классификаторы могут быть полезны при номинировании функциональных SNP в дополнительных локусах, идентифицированных в исследованиях полногеномной ассоциации орофациального расщепления.В локусах, где ген-кандидат экспрессируется в эпителии полости рта, например, IRF6, MAFB, FOXE1, TP63 , следует применять классификаторы, обученные zGPAE, mPEAE и hOEAE; если ген риска экспрессируется в базальном эпителии, например TP63 , классификатор, обученный mPEAE, может работать лучше, чем классификатор, обученный zGPAE. Если кандидатный ген риска экспрессируется в мезенхиме (например, PAX7 ), ожидается, что классификатор, обученный на mPMAE, будет наиболее точным.Важно отметить, что при исследовании более 100 SNP корреляция между оценками deltaSVM и эффектами SNP на уровне репортера (в соответствующем типе клеток) была значительной, но умеренной (Lee et al., 2015). Следовательно, анализ машинного обучения может отдавать приоритет SNP, но функциональные тесты остаются важными. Такие тесты включают количественную оценку влияния SNP на активность энхансера либо с помощью репортерных анализов in vitro, либо, что более эффективно, с помощью геномной инженерии соответствующей клеточной линии, чтобы сделать SNP гомозиготным по аллелю риска или без риска, а затем количественное определение уровней РНК. для ближайшего гена, релевантного риску.Эффективность гомологически направленной репарации для этой цели остается сильно зависимой от локуса, и нам не удалось применить ее здесь, хотя мы сделали это в другом локусе (Liu et al., 2017a). К счастью, инструменты редактирования одиночных нуклеотидов быстро улучшаются (Zafra et al., 2018; Anzalone et al., 2019). Наконец, анализы репортеров in vivo будут оставаться важными для тестирования тканевой специфичности энхансеров, несущих потенциальные функциональные SNP. В таких анализах явно желательна безопасная интеграция хроматина, хотя такие безопасные гавани могут быть более допустимыми для экспрессии в одних тканях, чем в других, а совместимость энхансер-промотор может дополнительно влиять на эффективность репортерных анализов in vivo (Quillien et al., 2017).

HD обои: картинки пришельцев, Евангелион неонового происхождения, Ева 02, Ева 00

HD обои: картинки пришельцев, Евангелион неонового происхождения, Ева 02, Ева 00 | Обои Flare инопланетяне картинки, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 02, EVA Unit 00, HD обои Информация об оригинальных обоях: Размер изображения: 3840x1080px Размер файла: 324.7KB WallpaperFlare - это открытая платформа, на которой пользователи могут делиться своими любимыми обоями. Загружая эти обои, вы соглашаетесь с нашими Условиями использования и Политикой конфиденциальности.Это изображение предназначено только для использования в качестве обоев рабочего стола. Если вы являетесь автором и обнаружите, что это изображение используется без вашего разрешения, сообщите нам о нарушении закона США "Об авторском праве в цифровую эпоху", пожалуйста, свяжитесь с нами Выберите разрешение и загрузите эти обои

Загрузите эти обои как настольные ПК и ноутбуки (включая разрешения 720P, 1080P, 2K, 4K, для обычных ПК и ноутбуков HP, Lenovo, Dell, Asus, Acer):

Загрузите эти обои как рабочий стол iMac:

iMac 21,5-дюймовый дисплей со светодиодной подсветкой:

1920x1080

Загрузите эти обои как рабочий стол MacBook:

MacBook Air 13 дюймов, MacBook Pro 15.4 ":

Полный размер - 1440x900

MacBook Pro с дисплеем Retina 13,3 дюйма, MacBook Air с дисплеем Retina 13 дюймов, MacBook Air 13,3 дюйма (2020, M1):

2560x1600

Загрузите эти обои как рабочий стол с двумя мониторами:

Скачать эти обои как рабочий стол с тройным монитором:

Скачать эти обои как рабочий стол для четырех мониторов:

Загрузите эти обои как рабочий стол iPhone или экран блокировки:

iPhone 2G, iPhone 3G, iPhone 3GS:

320 x 480

iPhone 4, iPhone 4s:

640 x 960

iPhone 5, iPhone 5s, iPhone 5c, iPhone SE:

640x1136

iPhone 6, iPhone 6s, iPhone 7, iPhone 8:

750x1334

iPhone 6 plus, iPhone 6s plus, iPhone 7 plus, iPhone 8 plus:

1242x2208

iPhone X, iPhone Xs, iPhone 11 Pro:

1125x2436

iPhone Xs Max, iPhone 11 Pro Max:

1242x2688

iPhone Xr, iPhone 11:

828x1792

iPhone 12 mini:

1080x2340

iPhone 12, iPhone 12 Pro:

1170x2532

iPhone 12 Pro Max:

1284x2778

Загрузите эти обои в качестве рабочего стола телефона Android или экрана блокировки (для обычных телефонов Samsung, Huawei, Xiaomi, Oppo, Oneplus, Vivo, Tecno, Lenovo с Android):

Загрузите эти обои как рабочий стол iPad или экран блокировки:

iPad, iPad 2, iPad Mini:

768x1024, 1024x768

iPad 3, iPad 4, iPad Air, iPad Air 2, iPad 2017, iPad Mini 2, iPad Mini 3, iPad Mini 4, 9.IPad Pro, 7 дюймов:

2048x1536, 1536x2048

iPad Pro 10,5 дюйма:

2224x1668, 1668x2224

iPad Pro 11 дюймов:

2388x1668, 1668x2388

iPad Pro 12,9 дюйма:

2732x2048, 2048x2732

iPad Air 10,9 дюйма:

2360x1640, 1640x2360

iPad 10,2 дюйма:

2160x1620, 1620x2160

Загрузите эти обои как рабочий стол или экран блокировки планшетов Surface и Android:

Похожие обои HD

  • 1920 г. Икс 1080 px

    synthwave, EVA Unit 01, паровая волна, Neon Genesis Evangelion
  • 1135 Икс 1600 px

    Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 02, EVA Unit 01, EVA Series
  • 1920 г. Икс 975 px

    Neon Genesis Evangelion обои, мех, EVA Unit 01, красный, без людей
  • 1980 г. Икс 1080 px

    Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 00, EVA Unit 01, EVA Unit 02
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Обои Neon Genesis Evangeleon, Neon Genesis Evangelion, Ева Unit 01
  • 11811 Икс 3675 px

    игровое приложение обои, произведение искусства, Neon Genesis Evangelion
  • 3840 Икс 1080 px

    минимализм, EVA Unit 02, EVA Unit 03, Eva Unit 06, EVA Unit 01
  • 2000 г. Икс 1064 px

    Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01
  • 1920 г. Икс 1080 px

    иллюстрация робота, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 02, EVA Unit 03
  • 2378 Икс 1007 px

    монстр идет к пирамиде обои, Neon Genesis Evangelion
  • 1920 г. Икс 1080 px

    цифровые обои робот персонаж, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01
  • 1135 Икс 1600 px

    Neon Genesis Evangelion, серия EVA, блок 01 EVA, блок 02
  • 1223 Икс 1920 г. px

    EVA Unit 01, Neon Genesis Evangelion, часть человеческого тела, цветной фон
  • 1280 Икс 873 px

    Neon Genesis Evangelion, аниме девушки, Ева Ева 01, Аянами Рей
  • 1500 Икс 844 px

    женское розово-черное платье, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Евангелион обои, Neon Genesis Evangelion, ЕВА Единица 01, ЕВА Единица 02
  • 1440 Икс 900 px

    Цифровые обои Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01, разноцветные
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Neon Genesis Evangelion, блок EVA 00, блок Евы 06, блок EVA 02
  • 4000 Икс 6000 px

    Neon Genesis Evangelion, 2D, мех, облака, EVA Unit 00, EVA Unit 02
  • 1400 Икс 909 px

    Neon Genesis Evangelion, мех, EVA Unit 01, Икари Синдзи, синий
  • 1920 г. Икс 1080 px

    обои черный дракон, Neon Genesis Evangelion, мех, ЕВА Единица 01
  • 2370 Икс 1080 px

    игровой постер, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01, природа, без людей
  • 3508 Икс 2480 px

    Neon Genesis Evangelion обои, ЕВА Единица 01, аниме, крест
  • 2008 г. Икс 1061 px

    Neon Genesis Evangelion, Аска Лэнгли Сорью, подразделение EVA 02
  • 1920 г. Икс 1080 px

    иллюстрация робота, сцена из фантастического фильма, EVA Unit 01, Neon Genesis Evangelion
  • 1920 г. Икс 1080 px

    женская пара белых туфель с открытым носком, Neon Genesis Evangelion
  • 2560 Икс 1440 px

    фиолетовый фон, Евангелион: 1.0, Neon Genesis Evangelion
  • 3840 Икс 1080 px

    робот с изображением пистолета, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01
  • 1920 г. Икс 1080 px

    аниме обои, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01, экстерьер здания
  • 1920 г. Икс 1080 px

    красно-черный деревянный стол, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 02
  • 1920 г. Икс 1081 px

    белый крест цифровая иллюстрация, Evangelion, Neon Genesis Evangelion
  • 1640 Икс 1180 px

    Ben10 инопланетная иллюстрация, аниме, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01
  • 5760 Икс 1200 px

    Neon Genesis Evangelion, Икари Синдзи, мех, Nerv, тройной экран
  • 2196 Икс 2735 px

    neon genesis evangelion eva unit 01 2196x2735 Аниме евангелион HD Art
  • 1920 г. Икс 1080 px

    красно-белая иллюстрация персонажа, Neon Genesis Evangelion
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01, без людей, природа, силуэт
  • 1600 Икс 900 px

    коричневые анимированные обои, EVA Unit 02, Spear of Longinus, Neon Genesis Evangelion
  • 1980 г. Икс 1080 px

    рисунок, EVA Unit 01, простой фон, EVA Unit 02, Neon Genesis Evangelion
  • 1920 г. Икс 1080 px

    игровое приложение обои, файтинг, Neon Genesis Evangelion
  • 1920 г. Икс 842 px

    Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01, ночь, подсветка, природа
  • 1920 г. Икс 1080 px

    иллюстрация синих и красных роботов, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 00
  • 2560 Икс 1080 px

    Neon Genesis Evangelion, мех, блок EVA 01
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Цифровые обои с персонажем робота Evangelion, Neon Genesis Evangelion
  • 4297 Икс 2417 px

    обои фиолетовый, зеленый и серый 01, Neon Genesis Evangelion
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Neon Genesis Evangelion, блок EVA 02, блок EVA 00, блок EVA 01
  • 5760 Икс 1200 px

    Nerv, тройной экран, EVA Unit 01, Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 00
  • 2560 Икс 1440 px

    Neon Genesis Evangelion, EVA Unit 01, без людей, студийный снимок
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Плакат Neon Genesis Evangelion, Икари Синдзи, Аянами Рей, Аска Лэнгли Сорю
  • 1920 г. Икс 1080 px

    анимированная женщина с роботом, аниме девушки, EVA Unit 00, мех
  • 2322 Икс 1584 px

    Евангелион, Neon Genesis Evangelion, Evangelion Unit-01, Рей Аянами
Загрузка обоев

Раков | Бесплатный полнотекстовый | NORE1A регулирует MDM2 через β-TrCP

1.Введение

Mouse Double Minute 2 Homolog (MDM2) представляет собой убиквитинлигазу E3 и служит ключевым регулятором главного опухолевого супрессора p53 [1]. MDM2 может отрицательно регулировать уровни белка p53 путем связывания и убиквитинирования p53. Эта посттрансляционная модификация приводит к ядерному экспорту р53 и последующей деградации протеасомой 26S [2]. Кроме того, показано, что MDM2 регулирует транскрипцию опосредованного p53 гена путем связывания и ингибирования его активности, а также подавления экспрессии локуса гена p53 [1].Однако эта ситуация дополнительно осложняется наблюдением, что p53 может стимулировать транскрипцию MDM2. Таким образом, p53 и MDM2 существуют в петле обратной связи, что приводит к сложным и, вероятно, тканеспецифичным взаимоотношениям [3]. Часто наблюдаемая сверхэкспрессия MDM2 в первичных опухолевых клетках хорошо коррелирует с потерей экспрессии p53 [4] и предполагает центральную физиологическую роль дисрегуляции MDM2 при заболеваниях человека. Активация онкопротеина Ras посредством точечной мутации часто встречается в опухолях человека [4]. 5].Ras также часто оказывается конститутивно активированным в отсутствие структурных мутаций из-за потери его негативных регуляторов, таких как NF1 (нейрофибромин 1) и DAB2IP (взаимодействующий с DAB2 белок) [6,7]. Известно, что гиперстимуляция сигнальных путей Ras трансформирует; однако постоянно высокие уровни активности Ras могут, наоборот, вызывать индуцированное онкогеном старение (OIS) в клетках, и это, как полагают, служит основным барьером для управляемой Ras трансформации и туморогенеза [8,9].Ras индуцирует OIS частично за счет активации p53 [9,10]. Однако Ras может также активировать MDM2 через путь Raf / MAPK, который должен действовать, чтобы подавлять уровни p53 [11]. Таким образом, механизмы, лежащие в основе связи между Ras и p53, сложны и включают как положительные, так и отрицательные эффекты [12]. Чистый эффект Ras на p53 в любой данной клетке, вероятно, будет зависеть от относительного баланса позитивных и негативных сигнальных механизмов. NORE1A (RASSF5) является членом семейства RASSF эффекторных / опухолевых супрессоров [13,14].Он может связывать Ras с индукцией апоптоза и старения и часто подавляется эпигенетическими методами в опухолевых клетках человека. NORE1A опосредует свои подавляющие опухоль эффекты частично через p53. NORE1A может образовывать комплекс с p53, изменяя специфические посттрансляционные модификации p53 [15]. Кроме того, NORE1A также способствует повышению уровня ядерного белка p53 [16], но механизм стабилизации p53, индуцированной NORE1A, остается неясным. Недавно мы показали, что NORE1A образует эндогенный комплекс с лигазой Skip-Cullin-F-Box-убиквитин E3. компонент распознавания субстрата β-TrCP, и может подстраивать его к специфическим мишеням для убиквитинирования и протеолитической деградации [17].Поскольку сообщалось, что NORE1A образует комплекс с MDM2 [18], и поскольку β-TrCP может способствовать деградации MDM2 [19], мы задались вопросом, может ли NORE1A действовать на p53 частично через деградацию MDM2. что NORE1A регулирует уровни белка MDM2 и что этот эффект зависит от β-TrCP. Более того, мы показываем, что Ras усиливает экспрессию эндогенного MDM2, если он не котрансфицирован с NORE1A, после чего он подавляет уровни MDM2. Наконец, мы показываем, что MDM2 подавляет способность NORE1A вызывать старение в мутантной линии опухолевых клеток Ras.Эти результаты объясняют, как NORE1A может регулировать уровни ядерного белка p53 и почему MDM2 может быть сверхэкспрессирован во многих опухолях. Поскольку MDM2 может регулировать другие важные белки, участвующие в контроле клеточного гомеостаза, такие как белок ретинобластомы [20], результаты могут иметь гораздо более широкое значение.

3. Обсуждение

Аберрантная активация онкогена Ras может привести к развитию индуцированного онкогеном старения (OIS). OIS подавляет трансформирующие эффекты Ras и является основным препятствием для развития опухоли [8,9].Механизмы, лежащие в основе OIS, и то, как он нарушается, чтобы способствовать злокачественному развитию опухоли, остаются плохо изученными. NORE1A является ключевым эффектором старения Ras, который может способствовать как увеличению ядерных уровней p53, так и усилению просенесцентных посттрансляционных модификаций p53 [15,16]. NORE1A часто инактивируется эпигенетическим процессом гиперметилирования промотора в опухолевых клетках человека. В образцах первичных опухолей человека потеря экспрессии NORE1A коррелирует с приобретением повышенной злокачественности и снижением просенесцентной передачи сигналов и активацией посттрансляционных модификаций p53 [15,16].Уровень экспрессии белка p53 в клетке контролируется многими регуляторами, но одним из наиболее важных и наиболее изученных является белок MDM2. MDM2 действует на нескольких уровнях, модулируя экспрессию p53 [3]. В частности, он убиквитинирует p53, способствуя ядерному экспорту и деградации протеасомой 26S. Поскольку MDM2 подавляет p53, неудивительно, что он должен проявлять онкогенную активность и проявлять сверхэкспрессию во многих первичных опухолях [1,4]. Помимо p53, MDM2 также участвует в регуляции ряда других важных медиаторов клеточного гомеостаза, включая супрессор опухолей Rb [20].Следовательно, действие MDM2 в клетке одновременно мощное и многогранное. Регуляция MDM2 сложна. На уровне белка эта убиквитинлигаза сама регулируется убиквитинлигазами, такими как SCF-β-TrCP [19]. Более того, MDM2 также обладает функцией автоубиквитинирования, которая делает возможным саморегуляцию [21]. Мы наблюдали, что NORE1A, по-видимому, не только стабилизирует ядерный p53, но также напрямую связывается с комплексом β-TrCP [17]. Недавно было показано, что NORE1A связывает MDM2 [18], но возможность для NORE1A модулировать стабильность MDM2 не рассматривалась.Мы предположили, что NORE1A может частично регулировать p53 посредством деградации MDM2. Наши результаты показывают, что NORE1A действительно нацелен на MDM2 для протеосомной деградации. Более того, используя мутант MDM2, который не может аутоубиквитинировать, а также доминантно отрицательную форму β-TrCP, мы подтвердили, что убиквитинирование происходит за счет β-TrCP, а не самого MDM2. Поскольку связывание β-TrCP с NORE1A зависит от Ras [17], неудивительно, что мы обнаружили, что NORE1A, по-видимому, связывает Ras с деградацией MDM2 (Рис. 5).RASSF1A родственен NORE1A и лучше охарактеризован как опухолевый супрессор [13]. Сообщалось также, что RASSF1A образует комплекс с MDM2 и способствует его деградации, чтобы стимулировать передачу сигналов p53 [22,23]. Однако было показано, что RASSF1A действует путем стимуляции внутренней активности убиквитинирования MDM2, тогда как мы обнаружили, что NORE1A все еще активен против мутантной формы MDM2, которая не может самоубиквитинировать [21]. Это можно объяснить сообщениями о том, что RASSF1A подавляет активность β-TrCP [24], а не стимулирует ее, как NORE1A.Таким образом, два члена семейства RASSF могут иметь разные механизмы действия, которые могут быть комплементарными в регуляции p53. NORE1A управляет старением, индуцируя просенесцентные посттрансляционные модификации как p53 [15], так и Rb [25]. Подавляя MDM2, NORE1A может также способствовать увеличению уровней общего белка p53 и Rb одновременно. Чтобы определить, насколько важно подавление MDM2 для индуцированного NORE1A старения, мы сверхэкспрессировали MDM2 в анализе старения NORE1A. Подавив систему деградации MDM2, мы смогли серьезно подавить способность NORE1A вызывать старение.Таким образом, NORE1A оказывает двоякое действие на p53: усиленное ацетилирование для стимуляции его просенесцентной программы транскрипции [15] и стабилизация общего ядерного белка посредством подавления MDM2. Поскольку мы также наблюдали стабилизацию Rb с помощью NORE1A [25], похоже, что этот эффект может также включать MDM2. Потребуются дальнейшие исследования для измерения относительного воздействия на стабильность p53 и Rb. Стратегии эпигенетической терапии для восстановления экспрессии NORE1A в опухолевых клетках и воссоединения Ras с p53 / Rb могут иметь значительный потенциал для противодействия опухолям, управляемым Ras.

4. Материалы и методы

4.1. Культура клеток

Клеточные линии HEK-293, A549 и HepG2 все имеют p53 дикого типа и были получены из ATCC (Mannassas, VA, USA) и выращены в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Mediatech / Corning, Mannassas, VA, США) и 1% пенициллин / стрептомицин (Corning, Mannassas, VA, USA). Клетки HEK-293 хорошо подходят для временных трансфекций. Клетки A549 лишены NORE1A и поэтому подходят для исследований комплементации NORE1A. Клетки HepG2 сохраняют экспрессию NORE1A и поэтому полезны для исследований нокдауна NORE1A.Клетки культивировали в 5% CO 2 при 37 ° C. Временные трансфекции выполняли с использованием либо jetPRIME® (Polyplus, Illkrich, France), либо реагента для трансфекции DNA-In TM A549 (Molecular Transfer, Гейтерсбург, Мэриленд, США).

4.2. Плазмиды
MDM2 человека дикого типа и мутантный MDM2, неспособные самоубиквитинировать (C464A), были получены от Addgene (№20935 и №12086) [21]. pcDNA-HA-NORE1A, pEGFP-NORE1A, pEGFP-β-TrCP, pEGFP-C1-β-TrCPΔFBOX и pmKate-2-C-H-Ras12V были описаны ранее [15,17,25].
4.3. Реагенты, вестерн-блоттинг и антитела.
Полные лизаты клеток получали путем сбора клеток в буфере RIPA (Sigma Aldrich, кат. № R0278, Сент-Луис, Миссури, США) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich, кат. № P8340). и ортованадат натрия в конечной концентрации 1 мМ. Анализ белков клеточных лизатов выполняли с использованием SDS-PAGE (NuPAGE 4–12% Bis-Tris Gels, Life Technolgies, Waltham, MA, USA), перенесенного либо на нитроцеллюлозу, либо на PVDF. Затем мембраны зондировали антителами против НА (Covance Research Products, Гринфилд, Индиана, США), MDM2 (Santa Cruz Biotechnologies Cat.# SC-965, Даллас, Техас, США), GFP (Санта-Круз Биотехнологии, кат. № SC-9996), RFP (Евроген, кат. № АВ234, Москва, Россия), β-TrCP (Кат. Даллас, Техас, США), β-актин (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и NORE1A (поликлональный кролик, описанный ранее [15,25]). Вестерн-блоты проявляли с использованием систем обнаружения West Pico или West Femto Enhanced ECL (Thermo Fisher, Rockford, IL, USA) и экспонировали на синей хемилюминесцентной пленке. Для ингибирования протеасомы 26S MG132 (Sigma Aldrich) добавляли в среду для культивирования клеток в конечной концентрации 10 мкМ в течение 12 часов.
4.4. Анализ старения
Клетки

A549 трансфицировали с использованием ДНК-In TM A549 и инкубировали в течение 72 часов. Затем клетки окрашивали на активность β-галактозидазы, характерного признака клеток, претерпевающих индуцированное онкогеном старение, с использованием набора от BioVision (BioVision, Milpitas, CA, USA). Клетки окрашивали в течение 12 часов, а затем количественно определяли с использованием пяти случайных полей, повторенных в трех анализах на образец.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *