Инвитро как переводится: Словарь и онлайн перевод на английский, русский, немецкий, французский, украинский и другие языки

Содержание

Растения ИНВИТРО что это

Статьи › ИНВИТРО

Выращивание растений в культуре in vitro — это современный метод вегетативного размножения растений, который позволяет получить генетически однородный, очищенный от вирусов посадочный материал для закладки промышленных плантаций ягод, садов, насаждений энергетических культур, массового тиражирования декоративных и

  1. Что такое рассада Инвитро
  2. Что значит саженец Инвитро
  3. Какие саженцы голубики лучше Инвитро или черенки
  4. Как переводится in vitro
  5. Что значит голубика ин витро
  6. Сколько стоит рассада астр
  7. Как вырастить растение в пробирке
  8. Что такое Микроклонирование
  9. Какие способы размножения у растений
  10. Сколько лет плодоносит куст голубики
  11. Сколько кустов голубики нужно сажать
  12. Нужно ли формировать куст голубики
  13. Что такое Инвитро и чем вы занимаетесь
  14. Что значит только для in vitro диагностики
  15. Как называется метод выращивание растений в закрытом грунте
  16. В чем преимущества технологии клонального микроразмножения растений
  17. Что такое рассада трей
  18. В чем заключается метод микроклонального размножения
  19. Что такое Споровое размножение растений
  20. Что такое Клональное Микроразмножение и как оно проводится
  21. Сколько голубики дает один куст
  22. В каком месяце сажать саженцы голубики
  23. Какой сорт голубики лучше посадить
  24. Как перевести for what
  25. Что такое Генеративное размножение растений
  26. Каковы этапы технологии клонального микроразмножения растений
  27. В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений егэ
  28. Почему чернеют черенки голубики
  29. Где лучше посадить куст голубики
  30. Можно ли укоренить ветку голубики
  31. Как называется метод выращивания растений в закрытом грунте
  32. В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений

Что такое рассада Инвитро

Производство саженцев в условиях in vitro — это, по сути, клонирование. В лабораторных условиях из изолированной ткани материнского растения берут клетки и помещают их в пробирку. Спустя время удается получить огромное число новых растений, на генетическом уровне абсолютно схожих с материнским экземпляром.

Что значит саженец Инвитро

In vitro — значит «в стекле»

Если цель состоит в том, чтобы быстро и качественно вырастить некое множество одинаково здоровых саженцев (например, малины, голубики или ежевики) то проще взять один заведомо здоровый экземпляр растения и размножить его вегетативно.

Какие саженцы голубики лучше Инвитро или черенки

По результатам исследований установлено, что кусты, полученные методом ин-витро обладают большим количеством листьев, большим размером листовой пластины, большим количеством побегов бокового ветвления, а так же большей урожайностью и продуктивностью чем черенкованные кусты.

Как переводится in vitro

Фраза in vitro («Ин витро»; с лат. — «в стекле») — термин и методика выполнения экспериментов, когда эксперименты проводятся «в пробирке» — в искусственных условиях, вне организма или естественной среды.

Что значит голубика ин витро

Голубика высокорослая (Vaccinium corymbosum L.) относится к семейству Вересковые (Ericaceae). В умеренном климате кустарник достигает высоты до 2-2,5 м. Плоды голубики высокорослой — ягоды диаметром до 3 см, собранные в грозди.

Сколько стоит рассада астр

198 ₽/шт.

Как вырастить растение в пробирке

Вначале с побегообразовательных участков растения берутся срезы тканей. Они помещаются в пробирки с жидким раствором (гормоны, витамины, микроэлементы). В таких условиях кусочек листа или корня быстро «превращается» в самостоятельное растение с зачатками всех вегетативных органов.

Что такое Микроклонирование

Размножение in vitro (микроклонирование) — вегетативное размножение растений из клеток материнского организма, базируется на явлении тотипотентности (способности из одной клетки создать целый новый организм).

Какие способы размножения у растений

Растения размножаются бесполым и половым способом. В процессе бесполого размножения участвует один родительский организм, который производит двух или более потомков. Потомки идентичны между собой и родительскому организму. Бесполое размножение подразделяют на собственно бесполое (спорообразование) и вегетативное.

Сколько лет плодоносит куст голубики

Урожаи ягод голубики высокой достигают 5-10 и более тонн с 1 га (с куста старше 6 лет можно получить от 5 до 10 кг ягод). Куст голубики на одном месте может расти и плодоносить не менее 30 лет.

Сколько кустов голубики нужно сажать

Особенности посадки голубики садовой.

Как мы уже говорили выше, рядом нужно посадить 2 — 3 саженца голубики, чтобы обеспечить хорошее перекрестное опыление. Лучше посадить три кустика на случай, если один вдруг погибнет. Выкопайте посадочные ямы глубиной и диаметром 45 см на расстоянии 1,5 м друг от друга.

Нужно ли формировать куст голубики

Когда куст голубики достигнет 5-ти летнего возраста для усиления его роста и обеспечения постоянного урожая необходимо произвести прореживание куста. Прореживание ускоряет процесс появления сильных однолетних побегов и обеспечивает регулярный урожай.

Что такое Инвитро и чем вы занимаетесь

ИНВИТРО — одна из крупнейших медицинских групп компаний в России, специализирующаяся на лабораторной диагностике и оказании медицинских услуг, основанная в 1995 году.

Что значит только для in vitro диагностики

In vitro диагностические тесты — медицинские тесты, проводимые в контролируемом окружении вне живого организма. In vitro — латинское выражение, означающее, букв. — «в стекле».

Как называется метод выращивание растений в закрытом грунте

Метод гидропоники Метод гидропоники основан на изучении корневой системы растения, а конкретно как происходит питание растения. Ученые работали десятки лет, чтобы понять, что же корень извлекает из почвы.

В чем преимущества технологии клонального микроразмножения растений

Возможность проведения работ в течение всего года; возможность автоматизации процесса выращивания. Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жорж Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения — регенеранты орхидей.

Что такое рассада трей

Клубника трей: что это за рассада

Tray plants — контейнерные или горшочные растения. Название указывает на тип хранения, распространения рассады. Зная особенности каждого типа, сможете планировать плантации, площадь под них, количество удобрений, полив и т. д.

В чем заключается метод микроклонального размножения

По своей сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает в пробирке в условиях in vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество новых растений.

Что такое Споровое размножение растений

Споровое размножение — это тип бесполого размножения, который осуществляется с помощью специализированных клеток — спор.

Что такое Клональное Микроразмножение и как оно проводится

Клональное микроразмножение — это получение растений неполовым путем в условиях in vitro, генетически идентичных исходному экземпляру. Тотипотентность лежит в основе клонального микроразмножения, это способность растительной клетки давать начало целому растительному организму.

Сколько голубики дает один куст

Первый полноценный урожай можно собрать через три года после посадки саженцев. При соблюдении всех условий выращивания можно рассчитывать на 4-8 кг ягод за сезон с одного куста.

В каком месяце сажать саженцы голубики

Голубику можно высаживать с весны до осени. Смотрите на внешний вид саженца, они всегда должны продаваться в кадках на 2 литра или горшках на 1,5-2 литра, если куст двухлетний. Если куст однолетний, то хотя бы на литр.

Какой сорт голубики лучше посадить

Сорт голубики Герберт — один из лучших, которые вы можете вырастить в своем саду. Это в полном смысле слова высокорослая голубика — высота куста может достигать 2,2 м! Конечно, плоды не такие гигантские, как у Бонуса, но все же довольно крупные — около 2 см в диаметре.

Как перевести for what

Перевод «for what?» на русский для чего? Ради чего? За что?

Что такое Генеративное размножение растений

Генеративным называется размножение с помощью семян. Оно может быть бесполым и половым. Таким способом размножаются папоротники, хвощи и мхи.

Каковы этапы технологии клонального микроразмножения растений

Этапы клонального микроразмножения: — отбор подходящих эксплантов, их стерилизация и перенос на питательную среду; — собственно микроразмножение; — укоренение побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям; — выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к посадке в поле. использоваться.

В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений егэ

Биология ЕГЭ 2023

ВОПРОС: В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений? ОТВЕТ: Этот метод применяется для выращивания культур клеток и тканей растений. Некоторое количество клеток помещают в питательную среду и выращивают определенное время.

Почему чернеют черенки голубики

Как правило, почернение побегов голубики высокорослой вызвано подмерзанием, а не болезнью. Чаще всего такую картину можно наблюдать ранней весной. Отдельные бутоны цветов и листьев становятся черными или коричневыми и не развиваются. Однолетние ветки могут погибнуть.

Где лучше посадить куст голубики

Голубику нужно сажать на солнечном месте, хорошо освещенном в течение всего светового дня. Посаженная в тени, она может вообще не плодоносить или давать очень маленькие урожаи.

Можно ли укоренить ветку голубики

Укоренение черенков

Можно сделать еще проще — вынуть грунт на глубину 20-25 сантиметров, а вместо него насыпать подготовленный для укоренения субстрат. Черенки голубики высаживают на грядку по схеме 5×5, 5×7, 5×10 или 10×10 сантиметров.

Как называется метод выращивания растений в закрытом грунте

Метод гидропоники Метод гидропоники основан на изучении корневой системы растения, а конкретно как происходит питание растения. Ученые работали десятки лет, чтобы понять, что же корень извлекает из почвы.

В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений

По своей сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает в пробирке в условиях in vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество новых растений.

  • В чем заключается суть метода микроклонального размножения растений егэ

«Инвитро» и «Перекрёсток» призывают перейти на ЗОЖ — Инвитро на vc.ru

Инвитро

«Инвитро» и торговая сеть «Перекрёсток» разработали совместный проект «Переходите на ЗОЖ вместе с нами» и через 3 месяца после старта продаж проанализировали, какие комплексы тестов пользуются наибольшей популярностью. В ходе проекта «Инвитро» разработала 6 наборов лабораторных анализов, каждый из которых ориентирован на определенный тип питания или набор привычек и помогает оценить состояние организма и возможную нехватку витаминов и минералов.

529 просмотров

Рейтинг популярности исследований

Самым популярным комплексом стал «Анализ уровня витамина D и минерального обмена», который выбрали более 3 тысяч человек. В комплекс входят исследования на витамин D, кальций, магний и фосфор. На втором месте по популярности исследование «Вегетарианство» – общий анализ крови, белка, железа и ферритина – сдали более тысячи человек. И третье место занял комплекс «Макро и микроэлементы» – более 500 человек. Исследование включает железо, цинк, селен, медь, кальций и магний. Минимальное количество покупателей выбрали комплекс «Веганы» – общий анализ крови, альбумин, гомоцистеин, кальций, витамин D. Интересно, что большая часть продаж этого комплекса пришлась на Северный Кавказ и Дальний Восток.

Всего за первые три месяца предложением воспользовались 5,9 тысяч человек по России. В топ-3 регионов по продажам вошли Москва, Московская область, Северо-Запад и Сибирь.

ЗОЖ для каждого свой

Кейс «Инвитро» и торговой сети «Перекрёсток» в очередной раз показал, что в современных реалиях компании даже из таких разных сфер бизнеса, как медицина и ритейл, могут объединяться, чтобы создавать качественные и удобные в использовании продукты для своих клиентов.

«Пищевые привычки и образ жизни оказывают значительное влияние на общее состояние организма. Нарушение режима питания может привести к дисбалансу питательных веществ, лишнему весу и ухудшению самочувствия. Поэтому важно проходить профилактическое обследование и делать это регулярно. Мы заботимся о своих покупателях, расширяя ЗОЖ-ассортимент и формируя привычки правильного питания. Но важно помнить, что ЗОЖ для каждого свой, и чтобы лучше понимать себя и свой организм, совместно с партнёрами мы предлагаем нашим клиентам исследования на специальных более выгодных условиях».

Татьяна Степанова, Директор по бренду и долгосрочной лояльности торговой сети «Перекрёсток»

Приобрести один из 6 комплексов и провести исследование можно во всех медицинских офисах «Инвитро». Для покупателей «Перекрёстка» действует специальная цена. Чтобы воспользоваться предложением, нужно выбрать исследование и предъявить карту Клуба «Перекрёсток» при оплате в офисе.

Проект запущен в мае и продлится до 31 декабря 2021 года. Больше подробностей по ссылке: https://www.invitro.ru/l/zozh-perekrestok/

Основы: трансляция in vitro | Thermo Fisher Scientific

Синтез белков in vitro в бесклеточных экстрактах является важным инструментом для молекулярных биологов и имеет множество применений, включая быструю идентификацию генных продуктов (например, протеомика), локализацию мутаций посредством синтеза укороченных генных продуктов, исследования фолдинга белков и включение модифицированных или неприродных аминокислот для функциональных исследований. Использование систем трансляции in vitro может иметь преимущества перед Экспрессия гена in vivo , когда сверхэкспрессированный продукт токсичен для клетки-хозяина, когда продукт нерастворим или образует тельца включения, или когда белок подвергается быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. В принципе должна быть возможность приготовить бесклеточный экстракт для

in vitro трансляции мРНК из любого типа клеток. На практике было разработано лишь несколько бесклеточных систем для синтеза белка in vitro . Как правило, эти системы происходят из клеток, вовлеченных в высокий уровень синтеза белка. В этой статье будут объяснены различные подходы к синтезу белка in vitro (трансляция очищенной РНК по сравнению с «связанной» и «связанной» транскрипцией: трансляция), а также описаны основные различия между эукариотическими и прокариотическими бесклеточными системами.
 

Быстрые ссылки

  • Cell Free Expression
  • Translation Systems
  • Wheat Germ Extract
  • E. coli Cell-Free System
  • «Linked» & «Coupled» Systems
  • Important Elements
  • Products
  • Primer Sequences
  • Ordering Информация

Бесклеточные системы экспрессии

Наиболее часто используемые бесклеточные системы трансляции состоят из экстрактов ретикулоцитов кролика, зародышей пшеницы и кишечной палочки. Все они готовятся в виде сырых экстрактов, содержащих все макромолекулярные компоненты (70S или 80S рибосомы, тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, факторы инициации, элонгации и терминации и т. д.), необходимые для трансляции экзогенной РНК. Для обеспечения эффективной трансляции каждый экстракт должен быть дополнен аминокислотами, источниками энергии (АТФ, ГТФ), энергорегенерирующими системами (креатинфосфат и креатинфосфокиназа для эукариотических систем и фосфоенолпируват и пируваткиназа для Е. 9).0003 coli lysate) и другие кофакторы (Mg2+, K+ и др.).

Существует два подхода к синтезу белка in vitro на основе исходного генетического материала: РНК или ДНК. Стандартные системы трансляции, такие как лизаты ретикулоцитов и экстракты зародышей пшеницы, используют РНК в качестве матрицы; тогда как «связанные» и «связанные» системы начинаются с матриц ДНК, которые транскрибируются в РНК, а затем транслируются. Каждая из этих систем обсуждается ниже.

Верх

Системы перевода

Лизат ретикулоцитов кролика
Лизат ретикулоцитов кролика представляет собой высокоэффективную систему синтеза эукариотических белков in vitro, используемую для трансляции экзогенных РНК (либо природных, либо созданных in vitro). In vivo ретикулоциты представляют собой высокоспециализированные клетки, в первую очередь ответственные за синтез гемоглобина, который составляет более 90% белка, вырабатываемого ретикулоцитом. Эти незрелые эритроциты уже потеряли свои ядра, но содержат адекватную мРНК, а также полный аппарат трансляции для интенсивного синтеза глобина. Эндогенная мРНК глобина может быть удалена инкубацией с Са2+-зависимой микрококковой нуклеазой, которая позже инактивируется хелатированием Са2+ с помощью EGTA. Ambion предлагает обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов. Этот тип лизата является наиболее широко используемой РНК-зависимой бесклеточной системой из-за его низкого фона и эффективного использования экзогенных РНК даже в низких концентрациях (рис. 1). Экзогенные белки синтезируются со скоростью, близкой к наблюдаемой в интактных ретикулоцитарных клетках.

Рис. 1. Стандартная процедура трансляции in vitro с использованием лизата ретикулоцитов кролика или экстракта зародышей пшеницы.

Необработанный лизат ретикулоцитов транслирует эндогенную глобиновую мРНК, экзогенную РНК или и то, и другое. Этот тип лизата обычно используется для изучения механизма трансляции, например. изучение влияния ингибиторов на трансляцию глобина. Как необработанные, так и обработанные лизаты ретикулоцитов кролика обладают низкой нуклеазной активностью и способны синтезировать большое количество полноразмерного продукта. Оба лизата подходят для синтеза более крупных белков из кэпированных или некэпированных РНК (эукариотических или вирусных).

Верх

Экстракт зародышей пшеницы

Экстракт зародышей пшеницы является удобной альтернативой бесклеточной системе с лизатом ретикулоцитов кролика. Этот экстракт имеет низкое фоновое включение из-за низкого уровня эндогенной мРНК. Лизат зародышей пшеницы эффективно транслирует экзогенную РНК различных организмов, от вирусов и дрожжей до высших растений и млекопитающих. Экстракт зародышей пшеницы рекомендуется для трансляции РНК, содержащей небольшие фрагменты двухцепочечной РНК или окисленные тиолы, ингибирующие лизат ретикулоцитов кролика. Экстракты как retic, так и зародышей пшеницы транслируют РНК, выделенную из клеток и тканей или генерируемую транскрипция in vitro (см. рис. 1). При использовании РНК, синтезированной in vitro , наличие 5′-кэп-структуры может усиливать трансляционную активность. Как правило, трансляция с помощью экстрактов зародышей пшеницы больше зависит от кэпа, чем трансляция с помощью экстрактов ретика. Если кэпирование РНК невозможно и выход белка из некэпированной мРНК низок, кодирующую последовательность можно субклонировать в прокариотический вектор и экспрессировать непосредственно с ДНК-матрицы в бесклеточной системе E. coli .

Верх

Бесклеточная система E.

coli

Бесклеточная система E. coli состоит из неочищенного экстракта, богатого эндогенной мРНК. Экстракт инкубируют во время приготовления, чтобы эта эндогенная мРНК транслировалась и впоследствии разрушалась. Поскольку уровни эндогенной мРНК в приготовленном лизате низкие, экзогенный продукт легко идентифицируется. По сравнению с эукариотическими системами экстракт E. coli имеет относительно простой аппарат трансляции с менее сложным контролем на уровне инициации, что позволяет этой системе быть очень эффективной в синтезе белка. Бактериальные экстракты часто непригодны для трансляции РНК, так как экзогенная РНК быстро расщепляется эндогенными нуклеазами. Есть некоторые вирусные мРНК (TMV, STNV и MS2), которые эффективно транслируются, поскольку они несколько устойчивы к активности нуклеаз и содержат стабильную вторичную структуру. Однако 9Экстракты 0067 E. coli идеально подходят для сопряженной транскрипции:трансляции с матриц ДНК.

Верх

«Связанная» и «связанная» транскрипция: системы трансляции

В стандартных реакциях трансляции очищенная РНК используется в качестве матрицы для трансляции. С другой стороны, «связанные» и «связанные» системы используют ДНК в качестве шаблона. РНК транскрибируется с ДНК и затем транслируется без какой-либо очистки. Такие системы обычно сочетают РНК-полимеразу прокариотического фага и промотор (T7, T3 или SP6) с экстрактами эукариот или прокариот для синтеза белков из экзогенных матриц ДНК. Матрицы ДНК для реакций транскрипции:трансляции могут быть клонированы в плазмидные векторы или созданы с помощью ПЦР (последовательности праймеров для трансляционных матриц, генерируемых ПЦР).

Linked Transcription:Translation
«Связанная» система представляет собой двухстадийную реакцию, основанную на транскрипции полимеразой бактериофага с последующей трансляцией в лизате ретикулоцитов кролика или лизате зародышей пшеницы (рис. 2). Поскольку реакции транскрипции и трансляции являются отдельными, каждая из них может быть оптимизирована для обеспечения полного функционирования обоих. И наоборот, многие коммерчески доступные эукариотические сопряженные системы транскрипции: трансляции скомпрометировали одну или обе реакции, так что они могут происходить в одной пробирке. Таким образом, производительность приносится в жертву удобству.

Рисунок 2. Linked in Vitro Процедура транскрипции и трансляции с использованием лизата ретикулоцитов кролика.

Парная транскрипция: трансляция
В отличие от эукариотических систем, в которых транскрипция и трансляция происходят последовательно, в E. coli транскрипция и трансляция происходят внутри клетки одновременно. Таким образом, системы трансляции E. coli in vitro выполняются таким же образом, в сочетании, в одной и той же пробирке при одних и тех же условиях реакции (одностадийная реакция; рис. 3). Во время транскрипции 5′-конец РНК становится доступным для связывания с рибосомой и подвергается трансляции, в то время как ее 3′-конец все еще транскрибируется. Это раннее связывание рибосом с РНК поддерживает стабильность транскрипта и способствует эффективной трансляции. Эта бактериальная система трансляции обеспечивает эффективную экспрессию продуктов как прокариотических, так и эукариотических генов за короткий промежуток времени. Для максимального выхода белка и наилучшей точности инициации убедитесь, что матрица ДНК имеет сайт связывания рибосом Шайна-Дальгарно выше кодона инициатора. Кэпирование эукариотической РНК не требуется. Использование 9Экстракт 0067 E. coli также устраняет перекрестную реактивность или другие проблемы, связанные с эндогенными белками в эукариотических лизатах. Кроме того, система экстрактов E. coli S30 допускает экспрессию из ДНК-векторов, содержащих природные промоторные последовательности E. coli (такие как lac или tac).

Рис. 3. Связанная транскрипция in vitro: процедура трансляции с использованием экстракта E. coli.

Верх

Важные элементы для трансляции

Существуют некоторые существенные различия между транскриптами мРНК прокариот и эукариот. Как правило, эукариотические мРНК характеризуются двумя посттранскрипционными модификациями: 5′-7-метил-GTP-кэп и 3′-поли(А)-хвост. Обе модификации способствуют стабильности мРНК, предотвращая деградацию. Кроме того, структура 5′-кэпа усиливает трансляцию мРНК, помогая связываться с эукариотической рибосомой и обеспечивая распознавание соответствующего инициирующего кодона AUG. Эта функция может варьироваться в зависимости от системы трансляции и конкретной синтезируемой мРНК. Консенсусная последовательность 5′-GCCACCAUGG-3′, также известная как последовательность «Козака», считается самым сильным сигналом связывания рибосом в эукариотической мРНК. Для эффективной инициации трансляции ключевыми элементами являются остаток G в положении +1 и остаток A в положении -3. мРНК, в которой отсутствует консенсусная последовательность Козака, может эффективно транслироваться в эукариотических бесклеточных системах, если она обладает умеренно длинной 5′-нетранслируемой областью (UTR), в которой отсутствует стабильная вторичная структура.

У бактерий рибосома направляется к месту инициации AUG богатой пуринами областью, называемой последовательностью Шайна-Дальгарно (SD). Эта последовательность комплементарна 3′-концу 16s рРНК в 30S рибосомной субъединице. Выше от инициирующего кодона AUG область SD имеет консенсусную последовательность 5′-UAAGGAGGUGA-3′. Конкретные мРНК значительно различаются по количеству нуклеотидов, которые дополняют анти-Шайн-Дальгарно последовательность 16S рРНК, от двух до девяти и более. Положение сайта связывания рибосомы (RBS) по отношению к инициатору AUG очень важно для эффективности трансляции (обычно от -6 до -10 относительно A сайта инициации).

Дополнительную информацию см. в разделе «Требования к последовательности сайтов связывания рибосом».

Верх

Продукты для трансляции in vitro

Компания Ambion в настоящее время предлагает одну бесклеточную систему трансляции:

Retic Lysate IVT Kit: Для эффективной трансляции транскриптов, синтезированных in vitro, поли(А) и тотальной РНК.

Верх

Последовательности праймеров для трансляционных матриц, созданных с помощью ПЦР

ДНК-матрицы для трансляции с использованием «сопряженной» или «связанной» транскрипции: системы трансляции можно легко создать с помощью ПЦР. Ниже представлены расположенные выше (5′) последовательности праймеров для получения продуктов ПЦР для управляемой Т7 транскрипции и последующей трансляции в лизате сетчатки и 9Экстракт 0067 E. coli соответственно. Обратите внимание, что также доступны системы трансляции, использующие полимеразы T3 или SP6. Чтобы создать шаблоны ПЦР для других полимераз, просто измените последовательность промотора T7 на последовательность T3 или SP6.


Top

Основы: трансляция in vitro | Thermo Fisher Scientific

Синтез белков in vitro в бесклеточных экстрактах является важным инструментом для молекулярных биологов и имеет множество применений, включая быструю идентификацию генных продуктов (например, протеомика), локализацию мутаций посредством синтеза укороченных генных продуктов, исследования фолдинга белков и включение модифицированных или неприродных аминокислот для функциональных исследований. Использование систем трансляции in vitro может иметь преимущества перед Экспрессия гена in vivo , когда сверхэкспрессированный продукт токсичен для клетки-хозяина, когда продукт нерастворим или образует тельца включения, или когда белок подвергается быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. В принципе должна быть возможность приготовить бесклеточный экстракт для in vitro трансляции мРНК из любого типа клеток. На практике было разработано лишь несколько бесклеточных систем для синтеза белка in vitro . Как правило, эти системы происходят из клеток, вовлеченных в высокий уровень синтеза белка. В этой статье будут объяснены различные подходы к синтезу белка in vitro (трансляция очищенной РНК по сравнению с «связанной» и «связанной» транскрипцией: трансляция), а также описаны основные различия между эукариотическими и прокариотическими бесклеточными системами.
 

Быстрые ссылки

  • Cell Free Expression
  • Translation Systems
  • Wheat Germ Extract
  • E. coli Cell-Free System
  • «Linked» & «Coupled» Systems
  • Important Elements
  • Products
  • Primer Sequences
  • Ordering Информация

Бесклеточные системы экспрессии

Наиболее часто используемые бесклеточные системы трансляции состоят из экстрактов ретикулоцитов кролика, зародышей пшеницы и кишечной палочки. Все они готовятся в виде сырых экстрактов, содержащих все макромолекулярные компоненты (70S или 80S рибосомы, тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, факторы инициации, элонгации и терминации и т. д.), необходимые для трансляции экзогенной РНК. Для обеспечения эффективной трансляции каждый экстракт должен быть дополнен аминокислотами, источниками энергии (АТФ, ГТФ), энергорегенерирующими системами (креатинфосфат и креатинфосфокиназа для эукариотических систем и фосфоенолпируват и пируваткиназа для Е. 9).0003 coli lysate) и другие кофакторы (Mg2+, K+ и др.).

Существует два подхода к синтезу белка in vitro на основе исходного генетического материала: РНК или ДНК. Стандартные системы трансляции, такие как лизаты ретикулоцитов и экстракты зародышей пшеницы, используют РНК в качестве матрицы; тогда как «связанные» и «связанные» системы начинаются с матриц ДНК, которые транскрибируются в РНК, а затем транслируются. Каждая из этих систем обсуждается ниже.

Верх

Системы перевода

Лизат ретикулоцитов кролика
Лизат ретикулоцитов кролика представляет собой высокоэффективную систему синтеза эукариотических белков in vitro, используемую для трансляции экзогенных РНК (либо природных, либо созданных in vitro). In vivo ретикулоциты представляют собой высокоспециализированные клетки, в первую очередь ответственные за синтез гемоглобина, который составляет более 90% белка, вырабатываемого ретикулоцитом. Эти незрелые эритроциты уже потеряли свои ядра, но содержат адекватную мРНК, а также полный аппарат трансляции для интенсивного синтеза глобина. Эндогенная мРНК глобина может быть удалена инкубацией с Са2+-зависимой микрококковой нуклеазой, которая позже инактивируется хелатированием Са2+ с помощью EGTA. Ambion предлагает обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов. Этот тип лизата является наиболее широко используемой РНК-зависимой бесклеточной системой из-за его низкого фона и эффективного использования экзогенных РНК даже в низких концентрациях (рис. 1). Экзогенные белки синтезируются со скоростью, близкой к наблюдаемой в интактных ретикулоцитарных клетках.

Рис. 1. Стандартная процедура трансляции in vitro с использованием лизата ретикулоцитов кролика или экстракта зародышей пшеницы.

Необработанный лизат ретикулоцитов транслирует эндогенную глобиновую мРНК, экзогенную РНК или и то, и другое. Этот тип лизата обычно используется для изучения механизма трансляции, например. изучение влияния ингибиторов на трансляцию глобина. Как необработанные, так и обработанные лизаты ретикулоцитов кролика обладают низкой нуклеазной активностью и способны синтезировать большое количество полноразмерного продукта. Оба лизата подходят для синтеза более крупных белков из кэпированных или некэпированных РНК (эукариотических или вирусных).

Верх

Экстракт зародышей пшеницы

Экстракт зародышей пшеницы является удобной альтернативой бесклеточной системе с лизатом ретикулоцитов кролика. Этот экстракт имеет низкое фоновое включение из-за низкого уровня эндогенной мРНК. Лизат зародышей пшеницы эффективно транслирует экзогенную РНК различных организмов, от вирусов и дрожжей до высших растений и млекопитающих. Экстракт зародышей пшеницы рекомендуется для трансляции РНК, содержащей небольшие фрагменты двухцепочечной РНК или окисленные тиолы, ингибирующие лизат ретикулоцитов кролика. Экстракты как retic, так и зародышей пшеницы транслируют РНК, выделенную из клеток и тканей или генерируемую транскрипция in vitro (см. рис. 1). При использовании РНК, синтезированной in vitro , наличие 5′-кэп-структуры может усиливать трансляционную активность. Как правило, трансляция с помощью экстрактов зародышей пшеницы больше зависит от кэпа, чем трансляция с помощью экстрактов ретика. Если кэпирование РНК невозможно и выход белка из некэпированной мРНК низок, кодирующую последовательность можно субклонировать в прокариотический вектор и экспрессировать непосредственно с ДНК-матрицы в бесклеточной системе E. coli .

Верх

Бесклеточная система E.

coli

Бесклеточная система E. coli состоит из неочищенного экстракта, богатого эндогенной мРНК. Экстракт инкубируют во время приготовления, чтобы эта эндогенная мРНК транслировалась и впоследствии разрушалась. Поскольку уровни эндогенной мРНК в приготовленном лизате низкие, экзогенный продукт легко идентифицируется. По сравнению с эукариотическими системами экстракт E. coli имеет относительно простой аппарат трансляции с менее сложным контролем на уровне инициации, что позволяет этой системе быть очень эффективной в синтезе белка. Бактериальные экстракты часто непригодны для трансляции РНК, так как экзогенная РНК быстро расщепляется эндогенными нуклеазами. Есть некоторые вирусные мРНК (TMV, STNV и MS2), которые эффективно транслируются, поскольку они несколько устойчивы к активности нуклеаз и содержат стабильную вторичную структуру. Однако 9Экстракты 0067 E. coli идеально подходят для сопряженной транскрипции:трансляции с матриц ДНК.

Верх

«Связанная» и «связанная» транскрипция: системы трансляции

В стандартных реакциях трансляции очищенная РНК используется в качестве матрицы для трансляции. С другой стороны, «связанные» и «связанные» системы используют ДНК в качестве шаблона. РНК транскрибируется с ДНК и затем транслируется без какой-либо очистки. Такие системы обычно сочетают РНК-полимеразу прокариотического фага и промотор (T7, T3 или SP6) с экстрактами эукариот или прокариот для синтеза белков из экзогенных матриц ДНК. Матрицы ДНК для реакций транскрипции:трансляции могут быть клонированы в плазмидные векторы или созданы с помощью ПЦР (последовательности праймеров для трансляционных матриц, генерируемых ПЦР).

Linked Transcription:Translation
«Связанная» система представляет собой двухстадийную реакцию, основанную на транскрипции полимеразой бактериофага с последующей трансляцией в лизате ретикулоцитов кролика или лизате зародышей пшеницы (рис. 2). Поскольку реакции транскрипции и трансляции являются отдельными, каждая из них может быть оптимизирована для обеспечения полного функционирования обоих. И наоборот, многие коммерчески доступные эукариотические сопряженные системы транскрипции: трансляции скомпрометировали одну или обе реакции, так что они могут происходить в одной пробирке. Таким образом, производительность приносится в жертву удобству.

Рисунок 2. Linked in Vitro Процедура транскрипции и трансляции с использованием лизата ретикулоцитов кролика.

Парная транскрипция: трансляция
В отличие от эукариотических систем, в которых транскрипция и трансляция происходят последовательно, в E. coli транскрипция и трансляция происходят внутри клетки одновременно. Таким образом, системы трансляции E. coli in vitro выполняются таким же образом, в сочетании, в одной и той же пробирке при одних и тех же условиях реакции (одностадийная реакция; рис. 3). Во время транскрипции 5′-конец РНК становится доступным для связывания с рибосомой и подвергается трансляции, в то время как ее 3′-конец все еще транскрибируется. Это раннее связывание рибосом с РНК поддерживает стабильность транскрипта и способствует эффективной трансляции. Эта бактериальная система трансляции обеспечивает эффективную экспрессию продуктов как прокариотических, так и эукариотических генов за короткий промежуток времени. Для максимального выхода белка и наилучшей точности инициации убедитесь, что матрица ДНК имеет сайт связывания рибосом Шайна-Дальгарно выше кодона инициатора. Кэпирование эукариотической РНК не требуется. Использование 9Экстракт 0067 E. coli также устраняет перекрестную реактивность или другие проблемы, связанные с эндогенными белками в эукариотических лизатах. Кроме того, система экстрактов E. coli S30 допускает экспрессию из ДНК-векторов, содержащих природные промоторные последовательности E. coli (такие как lac или tac).

Рис. 3. Связанная транскрипция in vitro: процедура трансляции с использованием экстракта E. coli.

Верх

Важные элементы для трансляции

Существуют некоторые существенные различия между транскриптами мРНК прокариот и эукариот. Как правило, эукариотические мРНК характеризуются двумя посттранскрипционными модификациями: 5′-7-метил-GTP-кэп и 3′-поли(А)-хвост. Обе модификации способствуют стабильности мРНК, предотвращая деградацию. Кроме того, структура 5′-кэпа усиливает трансляцию мРНК, помогая связываться с эукариотической рибосомой и обеспечивая распознавание соответствующего инициирующего кодона AUG. Эта функция может варьироваться в зависимости от системы трансляции и конкретной синтезируемой мРНК. Консенсусная последовательность 5′-GCCACCAUGG-3′, также известная как последовательность «Козака», считается самым сильным сигналом связывания рибосом в эукариотической мРНК. Для эффективной инициации трансляции ключевыми элементами являются остаток G в положении +1 и остаток A в положении -3. мРНК, в которой отсутствует консенсусная последовательность Козака, может эффективно транслироваться в эукариотических бесклеточных системах, если она обладает умеренно длинной 5′-нетранслируемой областью (UTR), в которой отсутствует стабильная вторичная структура.

У бактерий рибосома направляется к месту инициации AUG богатой пуринами областью, называемой последовательностью Шайна-Дальгарно (SD). Эта последовательность комплементарна 3′-концу 16s рРНК в 30S рибосомной субъединице. Выше от инициирующего кодона AUG область SD имеет консенсусную последовательность 5′-UAAGGAGGUGA-3′. Конкретные мРНК значительно различаются по количеству нуклеотидов, которые дополняют анти-Шайн-Дальгарно последовательность 16S рРНК, от двух до девяти и более.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *