Дегтярный переулок 11 б: Компании по адресу Санкт-Петербург, Дегтярный переулок, дом 11-б

Санкт-Петербург, Дегтярный пер., 11, лит. Б

фото:
Андрей Белимов-Гущин

опубликовано в журнале:
ПР90

2006–2010

реализация:
2010–2017

61 221 м²

общая площадь комплекса:
370 347,7 м²

количество корпусов:
10

(генеральный проектировщик)
Евгений Герасимов (руководитель проекта), Зоя Петрова (главный архитектор проекта), Татьяна Комалдинова, Евгения Резникова (руководитель группы), Ирина Бахорина, Наталья Безбородова, Александр Гвоздик, Татьяна Кузнецова, Олег Манов, Мария Орлова-Шейнер

nps tchoban voss
(генеральный архитектурный партнер стадии «концепция»)
Сергей Чобан (руководитель проекта), Валерия Каширина (руководитель группы), Фредерик Шольц, Павел Земсков

(проектирование фасадов, интерьеры общественных зон, разработка РД): Сергей Чобан (руководитель проекта), Вячеслав Казуль, Андрей Перлич, Сергей Арутюнов, Ольга Берлянд, Алия Боранбаева, Максим Гришанов, Татьяна Жукова, Андрей Кабанов, Анастасия Козырева, Марина Кузнецкая, Мария Кутовски, Юлия Лаврова, Артем Лисицын, Татьяна Локтева, Татьяна Любимова, Ольга Никитина, Анастасия Плотникова, Лариса Панасенко, Елена Плужник, Мария Рассказова, Екатерина Сенникова, Кристина Скуднова, Анастасия Тычинина, Анна Хмеленина, Яна Шестихина, Светлана Шилова

Если смотреть на общую концепцию комплекса (1-ю в 2-ю очередь), то он формируется двумя рядами простых по геометрии корпусов, размещенных вдоль длинных сторон участка и лучами расходящихся от здания Администрации, которое располагается со стороны Новгородской улицы. Одинаковые расстояния между корпусами и повторяющиеся размеры самих зданий образуют ритм второстепенных проходов, связывающих комплекс с его окружением.

Ядром композиции всего комплекса является внутренняя пешеходная площадь — именно к ней обращены вестибюли бизнес-центров, а также входы в расположенные на первых этажах магазины, кафе и запланированный фитнес-центр. Все входы также объединены двухэтажной галереей, связывающей по периметру площади все здания комплекса и делающей перемещение между ними комфортным в любую погоду.

На внутренней площади комплекса устроен танцующий фонтан с подсветкой и размещен сценический подиум. Сопла фонтана находятся на одной отметке с мощением, поэтому при отключении этот участок площади освобождается под зрительные места или прогулочную зону.

В основу проекта здания ратуши (Администрации) положена идея максимальной открытости деятельности органов исполнительной власти для горожан. Концепция «прозрачность власти» нашла свое непосредственное выражение в планировочных, фасадных и ландшафтных решениях сооружения. Обилие стекла в сочетании со светлым натуральным камнем колоннад, пилястр, порталов и карнизов создает современный, эффектный и представительный образ административного здания. Главный фасад, обращенный на Новгородскую улицу, оформлен протяженной колоннадой из 16 круглых колонн высотой 30 м. На остекленных участках фасада здания применяется система Double skin — двухслойный фасад. В облицовке цоколя использован гранит, а основным облицовочным материалом служит натуральный светлый травертин. Этот же материал присутствует на всех корпусах комплекса и дополняется камнями других сортов индивидуально для каждого здания.

Планировочная структура здания Администрации складывается вокруг проходного центрального атриумного пространства, которое вырастает из обширных открытых зон первого этажа, ступенчато трансформируется в цилиндрический объем центрального двора и вновь широко раскрывается в купольном пространстве космической линзообразной формы из металлоконструкций и стекла.

Особого внимания заслуживает купол в виде «летающей тарелки», венчающий здание: его выразительная форма уже органично вошла в городские панорамы и воспринимается как символ нового комплекса. Он образован 12 стальными криволинейными ножами-рамами переменного сечения — от 1,5 м в основании до 40 см у макушки купола — и системой ригелей, причем его верхняя отметка составляет 55 м. Остекление купола выполнено стеклопакетами с подогревом: в периметральной части применены гнутые стекла, в верхней части — солнцезащитные, а в зоне обзора городских панорам — просветленные.

интерьеры, материалы, мебель, акустика. Коворкинги. БЦ.

Газпром нефть – вертикально-интегрированная нефтяная компания, основные виды деятельности которой – разведка и разработка месторождений нефти и газа, нефтепереработка, а также производство и сбыт нефтепродуктов. Компания является лидером российской нефтяной индустрии по эффективности.

Бизнес-задача

Основной задачей проекта по строительству Дома инноваций в БЦ «Невская ратуша» было создать комфортную, эффективную и креативную среду для нового подразделения ПАО «Газпром нефть», которое специализируется на инновационных проектах в сфере IT. При этом было важно отразить новые корпоративные ценности, учесть возрастные группы сотрудников (около 50% коллектива – люди в возрасте от 27 до 38 лет) и отразить специфику новой дирекции.

Организация пространства

Дом инноваций расположен на 5-ом и 8-ом этажах БЦ «Невская ратуша» в историческом центре Санкт-Петербурга. Общая площадь занимаемых помещений составляет 2 898,8 кв. м.

На каждом этаже есть open space с различными форматами рабочих мест (в том числе и зона для тихой работы, требующей концентрации), зона hot-desk, кабины для телефонных переговоров, блок для командной работы, зоны для неформального общения, кухни и кофе-поинты, «комната тишины» и библиотека.

В офисе предусмотрено множество решений для проведения как «быстрых» встреч, так и длительных совещаний и конференц-коллов. В частности, есть переговорные комнаты разной вместимости, полуоткрытые и закрытые кабины на 2,4,6 и 8 человек.

Для приватных разговоров и более неформального общения установлены кресла и диваны, огороженные напольными акустическими панелями.

В рабочем пространстве отдельно выделены зона коворкинга, лекторий с трансформируемыми перегородками, где проводятся групповые обучения, презентации и общие собрания коллектива, и зоны инновационных разработок (designthinkinglab, лаборатория Blockchain, лаборатория видеоаналитики, лаборатория AR/VR).

Большая часть руководства работает в одном пространстве с линейными сотрудниками. При этом все отдельные кабинеты имеют двойное назначение – в отсутствие руководителя их используют как переговорные комнаты.

Незначительным ограничением при работе над офисом стала планировка самого бизнес-центра: необходимо было учесть «ядро», в котором размещены лифтовые холлы, и расположить рабочие зоны по периметру прямоугольного здания на 5-ом и 8-ом этажах. Также необходимо было максимально функционально использовать помещение офиса, поскольку требовалось разместить значительный штат сотрудников, сохранив при этом ощущение пространства и атмосферу демократичности.

Дизайн-идея

Дизайн-концепция офиса предполагала создание комфортного пространства для стимулирования идей. Интерьер должен был отражать такие ценности компании как инновационность, сотрудничество, целеустремленность, безопасность эффективность и ответственность. В офисе установлены мультимедиа и IT-решения, создан креативный ландшафт, поддерживающий сотрудничество между подразделениями дирекциями.

Важно было отразить «цифровую» направленность офиса. Так появились светильники-процессоры и система навигации офиса, имитирующая рисунок печатной платы.

Атмосферу творчества помогли создать яркие цветовые акценты в рабочих зонах. Также были применены акустические потолочные панели, акустические перегородки, шумопоглощающие экраны. Для психологического комфорта сотрудников в специальных зонах выбрана спокойная цветовая гамма.

Отделка некоторых стен и дверей имитирует поверхность грузовых контейнеров. Особое внимание было уделено технологиям отображения информации: в офисе размещены видеостены разных типов и конфигураций, вертикальные дисплеи в зоне трафика и мобильные электронные флипчарты для проведения обучений и совещаний.

Дарья Лупу

Руководитель направления по архитектурно-планировочным и интерьерным решениям, Комплекс Галерная 5

Создать среду для разработки инновационных решений, которая будет отличаться от других технологичных офисов — такую амбициозную задачу поставил перед нами заказчик. Инновации — это люди, и для них разработали креативный ландшафт, в котором найдется место для выполнения любой задачи: можно вместе с коллегами поработать в коворкинге, уютно разместиться на пуфе-мешке, сосредоточиться в зоне тихой работы или провести презентацию в лектории. И внешний вид — вместе с заказчикомудалось найти образ, близкий и понятный любому it-специалисту, — печатную плату, объединяющую все зоны — «кластеры» офиса. И самый главный результат — это идеи и проекты, появившиеся в офисе, видя их, понимаешь, что проектные решения «работают».

Андрей Белевцев

Директор дирекции по цифровой трансформации ПАО Газпром нефть

Дом Инноваций – это уникальное кросс-функциональное пространство для работы над проектами ПАО «Газпром нефть» с применением новых сквозных технологий и данных. Экосистема мобильных и комфортных, шеринговых рабочих мест, широкий выбор мультимедийных и интерактивных рабочих поверхностей, возможность удаленного включения из любой точки планеты, позволяют в полном объеме принять участие в сложных, технологических проектах. Значительно увеличивает эффективность работы команд. Новые форматы коммуникаций упрощают и ускоряют взаимодействие. Гармоничное сочетание рабочих пространств, зон командной работы и мест отдыха обеспечивают высокую вовлеченность в процессы. Мотивационными элементами в Доме инноваций являются декоративные панели со словами тригерами – Скорость, Уверенность, Мечтай и другими.

Проект-номинант Best Office Awards 2019!

Билеты на премию и предварительная регистрация на форум 30 мая

Каркас для сборки регуляторного переключателя в репликации ВИЧ.

Abstract. положительного комплекса факторов элонгации транскрипции b (P-TEFb). Домен трансактивации Tat связывается непосредственно с субъединицей CycT1 P-TEFb и индуцирует специфичное к петлевой последовательности связывание P-TEFb с зарождающейся РНК, отвечающей за трансактивацию ВИЧ-1 (TAR).Мы использовали систематическое РНК-белковое фотосшивание, вестерн-блот-анализ и белковый след, чтобы показать, что остатки 252–260 CycT1 взаимодействуют с одной стороной петли TAR РНК и усиливают взаимодействие остатка Tat K50 с другой стороной петли. Наши результаты показывают, что TAR РНК обеспечивает основу для двух белков-партнеров для связывания и сборки регуляторного переключателя в репликации ВИЧ. РНК-опосредованная сборка РНК-белковых комплексов может быть общим механизмом образования стабильного рибонуклеопротеинового комплекса и ключевым этапом в регуляции других клеточных процессов и репликации вируса.

ВИЧ-1 кодирует белок-активатор транскрипции Tat, который экспрессируется на ранних этапах жизненного цикла вируса и необходим для экспрессии, репликации и патогенеза вирусных генов (1–3). Tat усиливает процессивность комплексов элонгации РНК-полимеразы II (pol II), которые инициируются в области длинных концевых повторов ВИЧ. В ядерных экстрактах ВИЧ-1 Tat тесно связан с CDK9-содержащим положительным комплексом факторов элонгации транскрипции b, P-TEFb (4–6). Недавние исследования показывают, что Tat связывается непосредственно через свой домен трансактивации с субъединицей циклина T1 (CycT1) комплекса P-TEFb и индуцирует специфическое по петлевой последовательности связывание комплекса P-TEFb с РНК области, чувствительной к трансактивации (TAR) (7). –9).

Предполагается, что рекрутирование P-TEFb в TAR необходимо и достаточно для активации элонгации транскрипции с промотора длинных концевых повторов ВИЧ-1 (10). Ни CycT1, ни комплекс P-TEFb не связывают РНК TAR в отсутствие Tat; таким образом, связывание TAR является высоко кооперативным как для Tat, так и для P-TEFb (7, 9). На С-концевой границе циклинового домена CycT1 Tat, по-видимому, контактирует с остатками, которые не являются критическими для связывания CycT1 с CDK9 (8, 11-15). Исследования мутагенеза показали, что последовательности CycT1, содержащей аминокислоты 1–303, достаточно для образования комплексов с Tat-TAR и CDK9 (8, 11–15).Недавние исследования переноса энергии флуоресцентного резонанса с использованием TAR-РНК, меченной флуоресцеином, и белка Tat, меченного родамином, показали, что CycT1 ремоделирует структуру Tat для повышения его сродства к TAR-РНК, и что TAR-РНК дополнительно усиливает взаимодействие между Tat и CycT1 (16). .

Механизм, с помощью которого CycT1 индуцирует специфичное для последовательности петли связывание комплекса P-TEFb с зарождающейся РНК TAR ВИЧ-1, в настоящее время не изучен. Взаимодействует ли CycT1 непосредственно с петлей TAR или просто реорганизует структуру Tat для связывания остатков петли? Связывает ли Tat петлю TAR в присутствии CycT1? Какие области CycT1 и Tat непосредственно взаимодействуют с последовательностью петли TAR? Изменяет ли фосфорилирование P-TEFb область CycT1, которая контактирует с TAR РНК? Мы сообщаем здесь об использовании систематического сайт-специфического фотосшивания РНК-белка, вестерн-блоттинга и белкового следа для определения РНК-белковых взаимодействий при сборке комплекса P-TEFb-Tat-TAR.

Материалы и методы

Подготовка РНК и белков.

РНК, содержащие 4-тиуридин в определенных местах, были приобретены у Dharmacon (Lafayette, CO). РНК метили с 5′-конца 0,5 мкМ [γ- ³² P]АТФ [6000 Ки/ммоль (1 Ки = 37 ГБк, ICN] на 100 пмоль нуклеиновой кислоты путем инкубации с 16 единицами полинуклеотидкиназы Т4 ( NEB, Беверли, Массачусетс) в предоставленном буфере. РНК с 5′-концом очищали в 20% денатурирующем геле, визуализировали авторадиографией, элюировали из полиакриламидных гелей и обессоливали на картридже с обращенной фазой.HA-меченый Tat (аминокислоты 1–86), CycT1 (аминокислоты 1–303), (TK)-Tat (аминокислоты 1–86) и (TK)-CycT1 (аминокислоты 1–303) экспрессировались в Escherichia coli (штамм DHα) в качестве слитых белков глутатион S -трансфераза. Эти слитые белки состояли из N-концевой части глутатиона S -трансферазы, за которой следовал сайт расщепления тромбином. Метка гемагглютинина (НА) экспрессировалась на С-конце Tat. Сайт тимидинкиназы (ТК) был клонирован на N-конце Tat или CycT1(1-303).Клоны (HA)-Tat(1–86) и CycT1(1–303) были любезным подарком К. А. Джонса (Институт Солка, Ла-Хойя, Калифорния). Клон (TK)-Tat был получен из Национального института здоровья. Для клона (TK)-CycT1(1–303) последовательность ДНК CycT1, соответствующая аминокислотам 1–303, была встроена в плазмиду pGEX-2TK (Amersham Pharmacia) между сайтами рестрикции Bam HI и Eco RI. ДНК CycT1(1–303) получали с помощью ПЦР плазмиды pSF1 [глутатион S -трансфераза-CycT1(1–726)] со следующими праймерами: 5′-конец, 5′-GCGGATCCATGGAGGGAGAGAGGAA-3′ и 3′-конец , 5′-GCGAATTCTGACATGCTCATTAAACCTGCA-3′.Клоны были подтверждены секвенированием ДНК. Рекомбинантные слитые белки очищали от бактериальных лизатов с помощью гранул глутатион-сефарозы (Amersham Pharmacia) в течение 1 ч при 4°С. Затем гранулы выливали в колонку и промывали 10 мл буфера WB (1× PBS/1% Triton X-100/1 мМ EDTA/50 мкг/мл PMSF). Для мечения ³² P в ТК-сайте Tat и CycT1(1–303) гранулы уравновешивали 10 мл буфера PKA (50 мМ Tris⋅HCl, pH 7,4/10 мМ MgCl ₂ ), добавленного с 5 ед. каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы (Promega) и 200 мкКи [γ- ³² P]АТФ и инкубировали при комнатной температуре (КТ) в течение 20 мин.Затем шарики тщательно промывали буферами WB и TB (150 мМ NaCl/50 мМ Tris⋅HCl, pH 8,0/2,5 мМ CaCl ₂ /5 мМ DTT). Для извлечения белков гранулы глутатион-сефарозы обрабатывали 50 NIH единицами тромбина в 1 мл TB и встряхивали при комнатной температуре в течение 20 минут перед элюированием. Элюированные белки хранили аликвотами при -80°С. Экспрессию и очистку белков P-TEFb проводили, как описано Peng et al. (17).

Анализ связывания РНК с белком и реакции фотосшивки.

Типичная реакция связывания содержала 1 пмоль TAR РНК и 10 пмоль Tat и CycT1(1–303) или P-TEFb в буфере RBB (30 мМ Tris⋅HCl, pH 7,6/1% глицерин/3 мМ DTT/50 мМ KCl/5,4 мМ MgCl ₂ и 100 мкМ АТФ, где указано). Реакционные смеси (30 мкл) инкубировали при 30°С в течение 30 мин перед добавлением 20 мкл загрузочного буфера (60% глицерина/0,01% бромфенолового синего). Образцы загружали в 10% неденатурирующие полиакриламидные гели и выдерживали при 350 В в течение 1,5 часов. Для реакций фотосшивания связывающие смеси, содержащие РНК и белки, инкубировали при 30°С в течение 30 мин, а затем облучали (360 нм) в течение 20 мин.После облучения к реакционным смесям добавляли 20 мкл 2× буфера для загрузки SDS (100 мМ Tris⋅HCl, pH 6,8/200 мМ DTT/4% SDS/0,2% бромфенолового синего/20% глицерина) и образцы загружали на 15 % гелей SDS и запускают при 30 мА в течение 4 часов. Эффективность реакций связывания РНК с белком и перекрестного связывания определяли с помощью PhosphorImager (Molecular Dynamics). Для вестерн-блоттинга содержимое геля переносили на мембраны из поли(винилидендифторида) (Bio-Rad). Белок Tat обнаруживали с помощью иммуноблоттинга с конъюгированными с биотином мышиными антителами против метки HA (Roche Molecular Biochemicals).CycT1(1-303) и CycT1(1-726) были обнаружены с помощью N-концевых (N-19) и C-концевых (T-18) козьих поликлональных антител к CycT1 соответственно (Santa Cruz Biotechnology). Блоты визуализировали с помощью набора для блоттинга хемилюминесценции BM (Roche Molecular Biochemicals) и экспонировали с рентгеновскими пленками в течение различного времени (от 10 с до 1 мин).

Для реакций сшивания в препаративном масштабе использовали 1 нмоль TAR РНК, Tat и CycT1(1–303) или P-TEFb для образования РНК-белковых комплексов. Эти связывающие смеси облучали (360 нм) и разделяли с помощью 8 или 10% SDS/PAGE.Полосы РНК-белковых поперечных связей визуализировали с помощью авторадиографии и электроэлюировали в SDS-глициновом буфере (25 мМ Tris⋅HCl/250 мМ глицина, pH 8,3/0,1% SDS) при 200 В в течение 2 часов. Образцы диализовали в 50 мМ NH ₄ HCO ₃ в течение 1 ч и хранили при 4°C.

Идентификация сайтов перекрестных связей на РНК TAR, CycT1 и Tat.

Щелочной гидролиз свободных и сшитых ³² P-меченных TAR РНК проводили в гидролизном буфере (50 мМ Na ₂ CO ₃ /NaHCO ₃ , pH 9.2) при 85°С в течение 15–20 мин. РНК TAR, меченные на 5′-конце, инкубировали с 1 единицей рибонуклеазы T1 (Life Technologies, Rockville, MD) при 4°C в течение 2 мин в 10 мМ Tris⋅HCl, pH 8,0.

Очищенный ³² P-меченые Tat и CycT1(1–303) и их сшитые продукты (2 мкл в 10 мкл конечного реакционного объема) расщепляли протеазами для секвенирования в следующих условиях: 50 нг модифицированного трипсина (Promega) в 50 мМ NH ₄ HCO ₃ при 4°C в течение 1 мин; 0.1 мкг LysC в 25 мМ Tris⋅HCl, pH 8,0/1 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 10 мин; 0,1 мкг GluC в 50 мМ NH ₄ HCO ₃ , pH 7,8 при комнатной температуре в течение 5 мин; и 0,1 мкг ArgC в 100 мМ Tris⋅HCl, pH 7,6/10 мМ CaCl ₂ /5 мМ DTT/0,5 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 5 мин. LysC, GluC и ArgC были получены от Roche Molecular Biochemicals. Для расщепления Цис свободные и сшитые белки (2 мкл) инкубировали с 20 мкл буфера для расщепления (1 М мочевина/5 мМ β-меркаптоэтанол/210 мМ Трис·HCl, рН 8,8) при 37°С в течение 15 мин.После добавления 2 мкл 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты (NTCB, 10 мг/мл в CH ₃ OH) реакционную смесь выдерживали при 37°C в течение 15 мин с последующим добавлением 1 мкл 1 М NaOH и еще 20 мин при 37°С. Все реакции гасили добавлением 10 мкл загрузочного буфера SDS и замораживанием на сухом льду. Затем образцы нагревали при 100°C в течение 2 мин и сразу загружали в гели с 15% SDS. Гели запускали при 30 мА в течение 4,15 часов.

Результаты

CycT1 взаимодействует с нуклеотидом 31 в петле TAR и усиливает взаимодействие между Tat и нуклеотидом 34.

Чтобы определить прямые взаимодействия CycT1 и Tat с остатками петли TAR РНК, мы химически синтезировали три конструкции TAR РНК с фотоактивным нуклеозидом, 4-тиуридином, в положении 31, 33 или 34 (рис. ). Наш экспериментальный план по включению 4-тиуридина был основан на наблюдениях, что мутации в положениях 31 и 33 в петле TAR РНК существенно не снижали связывание CycT1-Tat. Единственная мутация в G34 до U34, однако, резко снижает связывание CycT1-Tat с TAR, и это связывание частично восстанавливается за счет компенсаторной мутации в положении C30 с A30 (18).Поэтому мы синтезировали функциональную РНК TAR, содержащую A30 и 4-тиуридин в положении 34, для экспериментов по перекрестному сшиванию (рис. 1). Последовательности РНК, содержащие 4-тиуридин в положении 31, 33 или 34, обозначаются как ^s U31, ^s U33 или A30- ^s U34 TAR РНК соответственно.

Сайт-специфическое фотосшивание в комплексах CycT1–Tat-TAR, содержащих 4-тиуридин. ( A ) Вторичная структура РНК TAR, используемая в этом исследовании. РНК TAR охватывает минимальные последовательности, необходимые для чувствительности Tat in vivo (32) и для связывания in vitro пептидов, происходящих от Tat (33).TAR дикого типа (wt) содержит две пары оснований, отличных от дикого типа, для увеличения транскрипции РНК-полимеразой Т7. Сайты включения 4-тиуридина, U31, G33 и G34, выделены жирным шрифтом в TAR РНК. Нумерация нуклеотидов в РНК соответствует их положению в TAR РНК дикого типа. ( B ) Анализ сдвига РНК в геле комплексов, содержащих рекомбинантные последовательности Tat, CycT1(1–303) и ^s U31, ^s U33 и A30– ^s U34 TAR РНК. Контрольные (С) дорожки не содержат белков.Дорожки 2 и 3, 5 и 6, 8 и 9 содержат возрастающие концентрации белковых комплексов (0,2 мкг Tat и 0,6–1,2 мкг CycT1). Стрелки указывают положение РНК и РНК-белковых комплексов. ( C – E ) Анализ продуктов фотосшивки РНК-белок. РНК TAR, содержащая ^s U в определенных положениях в петле, была помечена на 5′-конце и использована для образования комплексов с Tat и CycT1 или P-TEFb, облучена УФ-излучением (360 нм) и разделена на 15% SDS полиакриламидных гелях. Используемая РНК ^s U указана слева, а названия сшитых продуктов указаны справа.Буква «d» относится к димерам TAR РНК. Дорожка 1 (контрольная) содержит РНК без облучения. Продукты РНК-белковых перекрестных связей с Tat, CycT1(1–303) и полноразмерным CycT1 из P-TEFb обозначены как Tat ^XL , CycT1 (303) ^XL и CycT1 (726) ^XL . , соответственно.

Чтобы охарактеризовать и оценить способность связывания CycT1-Tat 4-тиуридинсодержащих TAR РНК, мы провели электрофоретические эксперименты по сдвигу подвижности (рис. B ). В сходных условиях CycT1-Tat связывал все три последовательности РНК ^s U TAR с различной эффективностью образования РНК-белкового комплекса: 75% с ^s U31 TAR, 60 % с ^s U33 TAR и 30 % с A30. — ^с U34 ТАР.Мы использовали CycT1(1-303) в этих анализах РНК-гелевого сдвига вместо P-TEFb по трем причинам: ( i ) этой области CycT1 достаточно для образования стабильных комплексов с Tat-TAR и CDK9 (8, 10-10). 14, 19–21), ( ii ) субъединица киназы CDK9 не влияет на специфичность CycT1 в отношении связывания Tat-TAR (8, 10–14, 19–21) и ( iii ) обнаружение CycT1( Комплекс 1-303)-Tat-TAR методами нативного гель-электрофореза является более простым и надежным по сравнению с комплексами P-TEFb-Tat-TAR или CycT1(1-726)-Tat-TAR.Эти результаты показывают, что все 4-тиуридинсодержащие последовательности РНК могут образовывать комплексы с CycT1-Tat.

Сайт-специфические реакции фотосшивания тройных комплексов, содержащих CycT1, Tat и ^s U TAR РНК, проводили путем облучения комплексов УФ-излучением (360 нм). Сшитые продукты анализировали путем денатурации 15% SDS/PAGE (фиг. C – E ). Облучение 4-тиуридинсодержащих TAR РНК белками дает полосы с меньшей электрофоретической подвижностью, чем у TAR РНК.Как показано на рис. C (дорожка 4), РНК TAR, содержащая 4-тиуридин в положении 31, образует высокоэффективную перекрестную связь с CycT1(1–303) в присутствии Tat, тогда как перекрестная связь Tat-TAR ссылка была второстепенным продуктом. Однако образование РНК-белкового продукта перекрестных связей с ^s U33 TAR было не очень эффективным, и как CycT1, так и Tat приводили к незначительным полосам перекрестных связей (фиг. D , дорожка 4). Интересно отметить, что перекрестная связь Tat-TAR была основным продуктом, когда A30- ^s U34 TAR подвергали фотопоперечной сшивке с Tat, но этот сильный выход наблюдался только в присутствии CycT1 (рис. E , полосы 2 и 4). Количество сшивки Tat-TAR не увеличивалось при использовании ТАР ^с U31 или ^с U33, а добавление CycT1 не изменяло выхода сшивки Tat-TAR (рис. C и D ). , полосы 2 и 4). Сшивание CycT1 с ^s U33 или A30- ^s U34 TAR было не очень эффективным (фиг. D и E , дорожка 4). Сшивание Tat со всеми тремя TAR ^s U без CycT1 приводило к получению продуктов сшивания с низким выходом (дорожка 2).CycT1 в отсутствие Tat не перекрестно связывался ни с одной из трех ^s U TAR РНК (рис. C – E , дорожка 3). Облучение ^s U TAR РНК привело к образованию второстепенного продукта сшивки, содержащего димер TAR («d» на рис. C – E ). Эти результаты демонстрируют, что CycT1(1-303) непосредственно взаимодействует с остатками петли TAR (U31, U33 и A30-U34), и сторона петли U31 является основным местом взаимодействия. Наши результаты также показывают, что в присутствии CycT1(1-303) Tat взаимодействует со стороной U34 петли TAR.

Было показано, что аутофосфорилирование CDK9 регулирует высокоаффинное связывание комплекса Tat-P-TEFb с TAR РНК, указывая на то, что это аутофосфорилирование индуцирует конформационные изменения в CycT1 для связывания TAR (22, 23). Чтобы определить эффекты фосфорилирования CDK9 на CycT1, мы провели наши эксперименты в присутствии и в отсутствие АТФ (рис. C – E , дорожки 5–7). Фосфорилирование CDK9 не оказывает существенного влияния на перекрестное связывание CycT1(1–303) с РНК TAR (дорожка 5), но фосфорилирование P-TEFb усиливает образование перекрестных связей CycT1(1–726)–TAR (дорожки 6 и 7).Контрольные эксперименты показали, что в отсутствие Tat P-TEFb не образует перекрестных связей с РНК TAR (рис. C – E , дорожка 8). Как и в случае с CycT1(1–303), полноразмерный CycT1 также образовывал перекрестные связи с наибольшим выходом с ^s U31 TAR РНК (дорожка 6). Эти результаты демонстрируют, что фосфорилирование P-TEFb усиливает взаимодействие полноразмерного CycT1 с TAR и не влияет на связывание CycT1(1-303)-TAR. Как полноразмерный CycT1, так и CycT1(1-303) взаимодействуют со стороной U31 петли РНК.

Идентичность белков, перекрестно связанных с РНК ^s U TAR, была подтверждена вестерн-блоттингом с антителами для обнаружения HA-Tat, CycT1(1–303) и CycT1(1–726).Tat сшивается с A30- ^s U34 TAR с высокой эффективностью (рис. A ). CycT1 (1–303) и полноразмерный CycT1 давали самый высокий выход перекрестных связей с ^с U31 TAR (фиг. B и C). Полноразмерные антитела CycT1 использовали для идентификации продуктов перекрестного сшивания с ^s U TAR РНК в присутствии P-TEFb и Tat. Эти результаты согласуются с выводами, показанными на рис., что ^s U31 TAR образует перекрестные связи CycT1-РНК с более высокой эффективностью по сравнению с последовательностями ^s U33 и A30- ^s U34 TAR.

( A – C ) Обнаружение продуктов фотосшивки РНК-белок методом вестерн-блоттинга. Продукты сшивания РНК-белок разделяли с помощью SDS/PAGE и переносили на поли(винилидендифторидные) мембраны, а содержание белка визуализировали иммуноблоттингом с антителами против HA (для HA-Tat) N- и C-концов CycT1. Антитела показаны слева, а конструкции ^s U TAR — над каждым пятном. ( A ) Анализ перекрестной связи Tat-TAR.Дорожка 1 (контрольная) содержит Tat без РНК или CycT1. На дорожке 2 показаны продукты фотосшивания Tat-CycT1(303) с A30- ^S U34 TAR. Белок Tat с меткой HA обнаруживали с помощью конъюгированного с биотином антитела против метки HA. ( B ) Анализ CycT1 (1–303), сшитого с ^s U31 TAR РНК. Дорожка 1 содержит CycT1 (1–303). Дорожка 2 содержит продукты фотосшивания CycT1(303)–Tat с РНК ^S U31 TAR. Сшитый продукт обнаруживали с помощью антитела CycT1 N-19 против N-концевой области CycT1.( C ) Сшитые продукты фотореакций, содержащие последовательности P-TEFb-Tat- ^s U TAR. Субъединица CycT1(1–726) P-TEFb, сшитая с ^s U31, ^s U33 и A30- ^s U34 TAR РНК, была обнаружена антителом CycT1 T-18 против С-концевой области ЦиклT1. На дорожке 1 (контроль) показан комплекс P-TEF-b без РНК. ( D ) Сайт-специфическое фотосшивание комплексов CycT1-Tat-TAR в неденатурирующих гелях. РНК-белковые комплексы, содержащие последовательности Tat, CycT1(1–303) и ^s U31, ^s U33 и A30- ^s U34 TAR РНК, меченные на 5′-конце, выделяли на неденатурирующих гелях, как описано на рис. .легенда и облучение (360 нм) в ловушке в геле. Затем продукты с поперечными связями анализировали с помощью 15% SDS/PAGE. Используемая РНК ^s U указана над каждой дорожкой. Продукты РНК-белковых перекрестных связей с Tat и CycT1(1-303) обозначены как Tat ^XL и CycT1 ^XL соответственно. ( E ) Количественный анализ реакций РНК-белкового сшивания. РНК A30- ^s U34 TAR помечена как 34.

Чтобы доказать, что реакции РНК-белкового сшивания были специфическими и происходили внутри комплексов, мы пометили концевые метки ^s U TAR РНК и инкубировали их с Tat и CycT1(1–303).РНК-белковые комплексы выделяли на неденатурирующих гелях. Затем мы облучили УФ-излучением захваченные комплексы «в геле» и разделили сшитые продукты на гелях с ДСН (рис. D ). Относительные соотношения перекрестных связей Tat и CycT1 были такими же, как и при проведении реакций перекрестного связывания «в растворе». Количественный анализ перекрестно-сшитых продуктов показал, что CycT1 и Tat перекрестно связаны с обеими сторонами петли TAR, поскольку сайты основных перекрестных связей для CycT1 и Tat были U31 и U34 соответственно (рис. Е ).

Положение поперечной связи на ^s U TAR РНК каждого сшитого продукта CycT1(1–303)–TAR оценивали с помощью щелочного гидролиза ³² P-меченой ^s U нуклеиновой кислоты . Идентичность фрагментов РНК была подтверждена расщеплением нуклеазой Т1 одноцепочечных гуанинов в петле TAR. В каждом случае лестница гидролиза РНК останавливалась на нуклеотиде перед тиомодифицированным основанием, что доказывало место перекрестного связывания с белком (рис.).

Картирование сшитых оснований в сшитых продуктах РНК-белок. дорожка 1, РНК с 5′-концом; дорожка 2, расщепление РНК нуклеазой Т1; дорожки 3 и 4 – лестница гидролиза TAR РНК при 85°C в течение 10 и 15 мин соответственно; дорожка 5, перекрестная связь РНК-белок; дорожки 6 и 7 — лестница гидролиза РНК-белковой сшивки при 85°С в течение 10 и 15 мин соответственно. Последовательность TAR РНК помечена справа, а сайты разрезания Т1 слева. РНК ^s U, использованная в каждом эксперименте, указана выше.

Аминокислоты CycT1 252–260 Перекрестная связь с нуклеотидом 31 на стороне петли TAR.

Образование ковалентных связей между 4-тиуридиновыми TAR РНК и белками свидетельствует о связывании CycT1 и Tat с 31 и 34 сторонами петли соответственно. Как взаимодействуют белки в комплексе CycT1–Tat-TAR и какие аминокислотные остатки тесно контактируют с петлей TAR? Чтобы ответить на эти вопросы, мы разработали анализ белкового следа как для CycT1, так и для Tat, сшитых с РНК TAR.

Чтобы исследовать область CycT1, поперечно сшитую со стороной U31 петли TAR, мы подвергли очищенный [ ³² P]CycT1(1–303)- ^s U31 TAR поперечно-сшитый продукт расщеплению протеазой и сравнили это продукты расщепления протеазами из несшитого (свободного) [ ³² P]CycT1(1–303). [ ³² P]CycT1 был помечен на N-конце, поэтому в этом анализе можно было обнаружить только фрагменты, содержащие N-конец. CycT1, сшитый с TAR РНК, имел более низкую скорость миграции, чем свободный CycT1, и, таким образом, каждый сгенерированный протеазой фрагмент, который был сшит с РНК, был обнаружен как сдвинутая полоса по сравнению с аналогом фрагмента, полученным при расщеплении свободного [ ³² P ]CycT1.Фрагменты, полученные в результате расщепления сшитого продукта, которые не были сдвинуты, указывают на области на N-конце сайта сшивания (фиг. A и B ).

Картирование областей CycT1 и Tat, фотосшитых с РНК TAR. ( A ) Схематическое изображение сайтов разрезания протеазы и NTCB в CycT1 (1–303). TRM, Tat:TAR узнаваемый мотив. ( B ) CycT1(1–303), меченный на N-конце ³² P, как описано, был фотосшит с немеченой ^s U31 TAR РНК и Tat.Чтобы найти сшитую область, сшитые (четные дорожки) и несшитые (нечетные дорожки) субъединицы CycT1 подвергали расщеплению протеазой и NTCB, как указано, и сравнивали картины расщепления в этих реакциях. Дорожки 1 и 2 (контроль) содержат очищенный необработанный CycT1. Образцы (дорожки 3–12) обрабатывали протеазами или химическими веществами, указанными выше. Идентифицированные сайты разрезов помечены справа: Lys для LysC, Arg для ArgC, Glu для GluC и Cys для NTCB.Расщепление трипсина идентифицировали в основном по Lys. Фрагменты, связанные с поперечно-сшитым TAR, мигрировали медленнее, чем несшитые фрагменты, и обозначены сайтом расщепления и ^XL (подробности см. в тексте). ( C ) Схематическое изображение сайтов разрезания протеазы и NTCB в Tat. ( D ) Tat, меченный на N-конце ³² P, как описано, был фотосшит с немеченой РНК A30- ^s U34 TAR и CycT1. Чтобы локализовать сшитую область, сшитые (четные дорожки) и несшитые (нечетные дорожки) Tat подвергали расщеплению протеазой и NTCB, как указано, и сравнивали картины расщепления в этих реакциях.Дорожки 1 и 2 (контрольные) содержат очищенный необработанный Tat. Образцы (дорожки 3–8) обрабатывали протеазами или химическими веществами, указанными выше. Идентифицированные сайты разрезания помечены справа: Lys для LysC и Arg для ArgC. Фрагменты, связанные с поперечно-сшитым TAR, мигрировали медленнее, чем несшитые фрагменты, и обозначены сайтом расщепления и ^XL (подробности см. в тексте).

Расщепление проводили с использованием четырех различных протеаз для секвенирования (трипсин для Arg и Lys, ArgC для Arg, LysC для Lys и GluC для Glu).Расщепление белка по остаткам Cys проводили с помощью NTCB. Идентичность полученных фрагментов устанавливали путем сравнения картины переваривания в указанных местах разреза. Результаты показаны на рис. A и B .

Поскольку только шесть остатков Cys распределены вдоль последовательности CycT1, расщепление NTCB по Cys позволило провести предварительное грубое картирование всего белка и определить область из 62 а.о., где располагался сайт перекрестного связывания. Расщепление происходило по всем остаткам Cys (аминокислоты 261, 205, 200, 198, 160 и 111) (рис. Б , переулок 9). Cys-205, Cys-200 и Cys-198 были обнаружены в виде одной полосы. Фрагмент 1–261 можно четко увидеть в свободном [ ³² P]CycT1 (рис. B , дорожка 9), но он смещен в сшитом CycT1 (дорожка 10). Расщепление NTCB как свободного, так и сшитого CycT1 в положении 198 дает идентичные полосы на геле. Этот анализ показал, что РНК была ковалентно сшита с областью CycT1 между аминокислотами 198 и 261.

Дальнейшее расщепление протеазами позволило нам сузить область, где происходило сшивание на CycT1.Релевантные для ArgC сайты разрезания были обнаружены в положениях 122, 165, 251 и 272. Паттерны расщепления сшитых и свободных белков ясно указывали на то, что РНК была связана с фрагментом 1–272, но не с фрагментом 1–251, поскольку только полоса белкового фрагмента, соответствующая 1–272, отсутствовала в расщеплении сшитого CycT1 (дорожки 11 и 12). Объединив эти результаты с данными расщепления NTCB по Cys, мы определили сшитую область в CycT1 до девяти аминокислот, 252–260.

Расщепление LysC, GluC и трипсина помогло нам подтвердить положение идентифицированных остатков.Четыре важных сайта разрезания GluC наблюдались в свободном CycT1 на 124, 137, 262 и 280 (дорожка 7). Когда поперечно-сшитый CycT1 расщепляли GluC, полосы 262 и 280 смещались, указывая на то, что сайт поперечной связи располагался перед остатком 262 с N-конца CycT1 (дорожка 8). Во время расщепления LysC произошло расщепление свободного CycT1 на 168, 247, 265–268 (появляется в виде одной полосы) и 277 (дорожка 5), а полосы, соответствующие 265–268 и 277, были смещены в сшитом CycT1 (дорожка 6). ). Расщепление трипсином было очень эффективным, и одна основная полоса, соответствующая Lys-265–268 и наблюдаемая в свободном CycT1 (дорожка 3), явно была смещена в сшитом продукте (дорожка 4).Эти полосы были подтверждены на гелях, которые запускали в течение более длительного времени, чтобы лучше разрешить полосы с высокой молекулярной массой (данные не показаны). Эти результаты показывают, что ^s U31 в петле TAR сшиваются с 10-аа областью CycT1, содержащей остатки 252–261.

Остаток Tat K50 перекрестно связывается с нуклеотидом 34 в петле TAR.

Затем мы проверили, какие остатки Tat образуют ковалентные связи с 4-тиуридином в положении 34 TAR, применяя ту же стратегию, которая использовалась для идентификации сшивающей области CycT1.Очищенный [ ³² P]Tat, сшитый с A30- ^s U34 TAR, и [ ³² P]Tat (свободный Tat) подвергали расщеплению ArgC, LysC и NTCB. Остатки Arg и Lys образуют основной домен Tat, который фланкирован последовательностями корового и богатого Gln доменов (а именно, аминокислоты 38–72; ссылка 24). N-конец (аминокислоты 1–22) и области, богатые Cys (аминокислоты 22–32), являются частью основного домена Tat (аминокислоты 1–48), который, как известно, необходим для взаимодействия Tat с CycT1. субъединица P-TEFb (1–3).Протеазы ArgC и LysC разрезают середину последовательности Tat, чтобы разделить области, связывающие РНК, и области, взаимодействующие с CycT1. Поэтому эти ферменты были выбраны для идентификации РНК- и CycT1-связывающих доменов по отдельности. Мы выбрали NTCB для картирования сшитых сайтов путем расщепления белка по остаткам Cys. Однако эта стратегия оказалась не очень полезной, поскольку NTCB расщепляется по остаткам Cys в основных условиях, а перекрестные связи РНК-Tat белков не были стабильными в этих условиях. Тем не менее, расщепление Tat NTCB было полезным для определения положения аминокислот в последовательности Tat.

Расщепление ArgC [ ³² P]Tat дало две полосы: одну второстепенную полосу, соответствующую расщеплению по R78, и другую основную полосу с небольшим размытым участком над ней, содержащую гетерогенную популяцию расщепленных фрагментов, вызванных ферментативным разрезанием по R57, — 56, -55, -53, -52 и -49 (рис. D , полоса 3). Расщепление ArgC сшитого [ ³² P]Tat показало сдвинутый фрагмент Tat 1–78 (обозначенный как R78 ^XL ), который, следовательно, содержит ковалентно связанный TAR (дорожка 4).Полоса, содержащая гетерогенную популяцию расщепленных фрагментов, была частично смещена (обозначена R57–55, 53–52 ^XL ) и частично не смещена (обозначена R49) (дорожка 4; см. ниже расщепление LysC).

Расщепление LysC [ ³² P]Tat дало три полосы: K29–28, K50–51 и K72 (дорожка 5). Расщепление LysC сшитого [ ³² P]Tat ясно показывает, что полосы, соответствующие K50–51 и K72, были сдвинуты, а полоса K29–28 – нет (дорожка 6). Поскольку K51-50 был смещен, несмещенная полоса на дорожке 4 была обозначена как R49, что указывает на то, что перекрестное связывание происходит после остатка 49 в последовательности Tat.Если бы поперечная связь образовалась на К51, фермент разрезал бы только на К50, и мы не увидели бы сдвинутого фрагмента. Однако, если перекрестное связывание произошло в точке K50, а LysC разрезали в точке K51, фрагмент белка был бы смещен, как это наблюдается (дорожки 4 и 6). Эти результаты показывают, что перекрестное связывание происходит в положении К50 в последовательности Tat, когда 4-тиуридин включается в положение 34 в петлю TAR.

Добавление C-терминальной области CycT1 и CDK9 не изменяет конформацию CycT1, взаимодействующую с TAR.

Мы показали, что CDK9, будь то в комплексах, содержащих CycT1(1-303) или CycT1(1-726), не влияет на эффективность перекрестного связывания 4-тиуридин-содержащего TAR с субъединицей CycT1.Было высказано предположение, что С-концевая область CycT1 играет аутоингибирующую роль, которая преодолевается эффектами фосфорилирования CDK9 в P-TEFb (22, 23). Изменяет ли добавление С-концевого домена CycT1 к CycT1(1-303) и CDK9 конформацию CycT1, которая может изменить области, которые сшиваются с TAR? Чтобы ответить на этот вопрос, мы подготовили ^S U31 TAR РНК с 5′-концом и фотосшивали ее с Tat и CycT1 или Tat и P-TEFb в присутствии АТФ, как описано на рис.легенда. Экспрессию и очистку белков P-TEFb проводили, как описано Peng et al. (17).

Продукты сшивания TAR РНК с CycT1(1–303) и CycT1(1–726) очищали и подвергали расщеплению трипсином в тех же условиях (рис. ). Паттерны фрагментов, вызванные расщеплением трипсином, были идентичны для обеих сшитых субъединиц CycT1 (дорожки 2–6 и 8–12). Эти результаты показывают, что добавление C-концевой области CycT1 и CDK9 не изменяет конформацию CycT1, взаимодействующую с TAR.

Идентичные участки CycT1 в P-TEFb и CycT1(1–303) сшиваются с TAR РНК. ^S U31 TAR РНК была помечена на 5′-конце и использовалась для образования комплексов с Tat и CycT1(1–303) или P-TEFb. Эти комплексы облучали, очищали и расщепляли трипсином. Дорожки 1 и 7 (контроль) содержат необработанные перекрестные связи CycT1(1–303)–TAR и CycT1(1–726)–TAR. Сшивки РНК-белок расщепляли 50 нг трипсина в идентичных условиях на дорожках 2–6 и 8–12. Дорожки 2 и 8, 4°С в течение 5 мин; дорожки 3 и 9, 25°С, 5 мин; дорожки 4 и 10, 30°С, 5 мин; дорожки 5 и 11, 37°С в течение 10 мин; дорожки 6 и 12, 37°С в течение 1 часа.

Обсуждение

Взаимодействие между P-TEFb, Tat и TAR является ключевым этапом в процессе трансактивации ВИЧ-1. Известно, что взаимодействие между Tat и TAR включает аминокислоты 48–57 в белковой части и нуклеотиды в области выпуклости нуклеиновой кислоты. Известно, что петля РНК TAR придает специфичность образованию комплекса P-TEFb-Tat-TAR, что позволяет дифференцировать вирусы иммунодефицита среди разных видов-хозяев. Однако способ взаимодействия между белковым комплексом и петлей TAR еще не выяснен.

В этом отчете мы показали, что как субъединица CycT1 комплекса P-TEFb, так и Tat непосредственно взаимодействуют с различными нуклеотидами в петле TAR. ЯМР-исследования (25, 26) и исследование третичной укладки РНК с помощью связанного хелата железа (27) показали, что петля-шпилька TAR-РНК имеет гибкую структуру в растворе. Наши результаты перекрестного связывания, показывающие специфическое взаимодействие белков с двумя сторонами петли TAR, позволяют предположить, что петля-шпилька TAR принимает более определенную структуру после связывания с комплексом Tat-CycT1, так что CycT1 и Tat связываются с двумя сторонами петли и взаимодействуют. со специфическими функциональными группами.Мы исследовали, участвуют ли эти соответствующие химические группы в петле TAR во взаимодействиях с белками, путем включения 4-тиуридиновых нуклеотидов на разных сторонах петли, которые после УФ-облучения образуют ковалентные связи с вицинальными химическими остатками.

Когда 4-тиогруппа была введена в положение 31, мы обнаружили, что субъединица CycT1 [в комплексах CycT1(1–303)–Tat-TAR или P-TEFb–Tat-TAR] была ковалентно связана с TAR РНК. Когда 4-тиогруппа была перемещена в положение 33 или 34 внутри петли TAR, количество CycT1, сшитого с РНК, резко уменьшилось.Один Tat, по-видимому, слабо связывался со всеми сторонами 4-тио-модифицированной петли. Интересно, что когда к комплексу добавляли CycT1, Tat демонстрировал более высокую аффинность ковалентного связывания с 34-й стороной петли и более низкую аффинность к области нуклеотида 31. Напротив, добавление CycT1 не влияло на низкую скорость сшивания Tat в положении 33. Ни CDK9 в комплексе, ни CycT1 в отсутствие Tat не обнаруживали никакого связывания с петлей TAR.

Последующие исследования расщепления протеазами комплекса Tat-CycT1(1–303)–TAR и двух основных сшитых продуктов (CycT1- ^S U31 и Tat-A30 ^S U34 TAR) установили, что остатки между амино кислоты 252 и 261 в субъединице CycT1 участвуют в сшивании с ^S U31, а остаток Lys-50 в Tat сшивается с положением 34 TAR в присутствии CycT1.Эти результаты позволяют нам предложить модель взаимодействия P-TEFb-Tat-TAR. Когда к TAR РНК добавляется только Tat, он связывается в основном с областью bulge, к которой он проявляет более высокое сродство, и устанавливает неспецифические контакты с нуклеотидами в возможно флуктуирующей петлевой структуре. В присутствии CycT1 или комплекса P-TEFb CycT1 связывается как с Tat, так и со стороной 31 нуклеотида петли TAR, возможно, индуцируя структурные изменения в TAR или Tat и TAR, где Tat специфически взаимодействует со стороной 34 нуклеиновой кислоты. Инжир.). Связывание CycT1 и Tat с TAR РНК является высококооперативным, и наблюдались емкость 85,5 ± 0,5%, коэффициент Хилла 2,7 и константа диссоциации ( K _D ) 2,45 ± 0,02 нМ (18), что указывает на то, что представляют собой три сайта связывания на TAR РНК. CycT1 не связывает РНК TAR в отсутствие Tat, а связывание Tat с TAR, хотя и обнаруживается, очень неэффективно в отсутствие CycT1 (18). Вполне возможно, что гетеродимер CycT1-Tat напрямую связывается с РНК TAR в богатой U выпуклой области РНК, и это связывание облегчает взаимодействие CycT1-Tat в двух других участках петли РНК, где CycT1 взаимодействует со стороной U31 и Tat связывается со стороной G34.

Схематическое изображение тройного комплекса P-TEFb–Tat-TAR. P-TEFb представляет собой двухсубъединичный киназный комплекс, содержащий CDK9 и CycT1. Субъединица CDK9 P-TEFb связывается с последовательностью циклинового бокса (аминокислоты 1–250) CycT1. Мотив распознавания Tat:TAR (TRM) в последовательности CycT1 охватывает аминокислотные остатки 251–272, что необходимо для образования комплекса с РНК Tat и TAR. Аминокислотная последовательность 252–260 из TRM была сшита со стороной U31 петли TAR, что позволяет предположить, что остатки 261–272 участвуют во взаимодействии с коровым доменом Tat (аминокислоты 1–48), показанным в виде круглого шара, указывающего на компактная структура.РНК распознается Arg-богатым мотивом распознавания РНК (ARM) Tat, а Lys-50 взаимодействует со стороной G34 петли TAR. Связывание CycT1 и Tat с TAR РНК является высококооперативным, и наблюдались емкость 85%, коэффициент Хилла 2,7 и константа диссоциации ( K _D ) 2,45 нМ (18), что указывает на наличие трех сайтов связывания на ТАР РНК. Вполне возможно, что гетеродимер CycT1-Tat напрямую связывается с РНК TAR в области выпуклости U-богатой РНК, и это связывание облегчает взаимодействие CycT1-Tat в двух других участках петли РНК: CycT1 взаимодействует со стороной U31, и Tat связывается со стороной G34.Аминокислоты, сшитые с РНК TAR, показаны сплошными стрелками, а предполагаемая Tat-взаимодействующая область TRM показана пунктирной стрелкой. CycT1 показан голубым цветом, CDK9 — синим, а Tat — розовым. N- и C-концы белков обозначаются как NH ₂ и COOH соответственно.

Интересно, что РНК TAR обеспечивает каркас для связывания двух белков-партнеров и для сборки регуляторного переключателя репликации ВИЧ. Недавно было показано, что TAR РНК сильно усиливает взаимодействие между Tat и CycT1 (16).РНК-индуцированные белок-белковые взаимодействия были задокументированы наиболее четко с белком λN, который связывается с сайтом в boxB РНК, чтобы обеспечить антитерминацию транскрипции (28-31). Регуляция белковых взаимодействий посредством структурных изменений в РНК может быть важным механизмом контроля порядка сборки комплекса Tat-P-TEFb-TAR, чтобы гарантировать, что Tat не будет связываться с TAR в отсутствие CycT1 (P-TEFb). ) и что P-TEFb предпочтительно используется на вирусном промоторе, поскольку клеточные гены не экспрессируют РНК TAR.Этот архитектурный механизм сборки РНК-белков может быть ключевым шагом в регуляции других клеточных процессов и репликации вируса.

Каркас для сборки регуляторного переключателя репликации ВИЧ на JSTOR

Для репликации ВИЧ требуется белок Tat, который активирует удлинение транскрипции РНК-полимеразы II на промоторе ВИЧ-1 путем взаимодействия с субъединицей циклина T1 (CycT1) положительного комплекса факторов элонгации транскрипции b (P-TEFb).Домен трансактивации Tat связывается непосредственно с субъединицей CycT1 P-TEFb и индуцирует специфичное к петлевой последовательности связывание P-TEFb с зарождающейся РНК, отвечающей за трансактивацию ВИЧ-1 (TAR). Мы использовали систематическое фотосшивание РНК-белок, вестерн-блот-анализ и белковый след, чтобы показать, что остатки 252-260 CycT1 взаимодействуют с одной стороной петли TAR РНК и усиливают взаимодействие остатка Tat K50 с другой стороной петли. Наши результаты показывают, что TAR РНК обеспечивает основу для двух белков-партнеров для связывания и сборки регуляторного переключателя в репликации ВИЧ.РНК-опосредованная сборка РНК-белковых комплексов может быть общим механизмом образования стабильного рибонуклеопротеинового комплекса и ключевым этапом в регуляции других клеточных процессов и репликации вируса.

PNAS — самый цитируемый в мире междисциплинарный научный сериал. Он публикует высокоэффективные исследовательские отчеты, комментарии, перспективы, обзоры, документы коллоквиума и действия Академии. В соответствии с руководством принципы, установленные Джорджем Эллери Хейлом в 1914 году, публикует PNAS краткие первые объявления членов Академии и иностранных партнеров подробнее важный вклад в исследования и работы, которые, по мнению члена, иметь особое значение.

Национальная академия наук (НАН) — частная некоммерческая организация ведущих исследователей страны. NAS признает и продвигает выдающуюся науку путем избрания в члены; публикация в своем журнале PNAS; и его награды, программы и специальные мероприятия. Через Национальные академии наук, инженерии и медицины NAS предоставляет объективные, научно обоснованные рекомендации по важнейшим вопросам, затрагивающим нацию.

Характеристика РНК-связывающего белка TAR человека, который активирует LTR ВИЧ-1 в JSTOR

Экспрессия гена вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) активируется Tat, белком, кодируемым вирусом. Для трансактивации Tat требуются вирусные (реагирующие на трансактивацию; TAR) последовательности РНК, расположенные в области R длинного концевого повтора (LTR). Существующие данные свидетельствуют о том, что Tat, вероятно, взаимодействует с клеточными факторами, которые связываются с TAR РНК в общем процессе трансактивации.Была выделена и охарактеризована комплементарная ДНК HeLa, которая кодирует РНК-связывающий белок TAR (TRBP). TRBP активировал LTR ВИЧ-1 и был синергичен с функцией Tat.

Science, основанный Томасом А. Эдисоном в 1880 году и издаваемый AAAS, сегодня считается журналом общей науки с самым большим тиражом в мире. Публикуемый 51 раз в год журнал Science известен своими высоко цитируемыми, рецензируемыми исследовательскими работами, особой силой в медико-биологических дисциплинах и отмеченным наградами освещением последних научных новостей.Онлайн-издание включает не только полные тексты текущих выпусков, но и научные архивы, относящиеся к первому изданию Эдисона в 1880 году. Научные карьеры, которые можно найти в печати и в Интернете, содержат соответствующие статьи о карьере, публикуемые еженедельно, тысячи объявлений о вакансиях обновляются несколько раз в неделю. неделя и другие услуги, связанные с карьерой. В интерактивном научном мультимедийном центре представлены научные подкасты, изображения и слайд-шоу, видео, семинары и другие интерактивные функции. Для получения дополнительной информации посетите сайт www.sciencemag.org.

AAAS, основанная в 1848 году, превратилась в крупнейшее в мире междисциплинарное научное общество, насчитывающее почти 130 000 членов и подписчиков. Миссия «продвигать науку, технику и инновации во всем мире на благо всех людей» вывела организацию на передний план национальных и международных инициатив. Глобальные усилия включают программы и партнерства по всему миру, от Азии до Европы и Африки, а также обширную работу в области прав человека с использованием геопространственных технологий для подтверждения нарушений.Научные и политические программы включают крупный ежегодный форум по политике в области науки и техники, стипендии по политике в области науки и техники в Конгрессе США и государственных учреждениях, а также отслеживание финансирования США исследований и разработок. Инициативы в области естественнонаучного образования заложили основу для обучения на основе стандартов и предоставили учителям веб-инструменты поддержки. Деятельность по привлечению общественности способствует открытому диалогу с учеными по таким социальным вопросам, как глобальное изменение климата. AAAS также действует как зонтичная организация для федерации более чем 270 дочерних научных групп.Расширенная серия веб-сайтов включает исчерпывающие ресурсы по развитию карьеры. Для получения дополнительной информации посетите сайт www.aaas.org.

Таррантский оценочный округ

Нулевое значение указывает на то, что запись об имуществе еще не завершена для указанного налогового года
† Оценочная стоимость может быть меньше рыночной стоимости из-за установленных государством ограничений на увеличение стоимости.

Надмолекулярные геликаты железа(II) препятствуют взаимодействию Tat-TAR РНК ВИЧ-1, имеющему решающее значение для репликации вируса

установка программного обеспечения — Как установить файл .tar.gz (или .tar.bz2)?

Только для файлов .tar.* , код которых предварительно скомпилирован, но упакован в файл tar.

Хорошо, это довольно сложная задача для новичка, но просто следуйте моим инструкциям, и все должно получиться.

Прежде всего, загрузите файл .tar.* и сохраните его.Не открывай его. (В этих примерах я буду устанавливать бета-версию Dropbox, потому что я все равно собирался ее установить, поэтому решил задокументировать установку.)

После загрузки файла (при условии, что вы сохранили его в папке Downloads ,) введите следующее:

  компакт-диск Загрузки
sudo cp dropbox-lnx.x86_64-1.5.36.tar.gz /opt/
  

ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте имя файла, который вы скачали. (например, для Firefox Nightly 19.0a1 64-битная сборка, введите sudo cp firefox-19.0a1.en-US.linux-x86_64.tar.bz2 /opt/ )

Теперь перейдите в каталог /opt/, распакуйте программу и удалите старый файл:

  диск /опция/
sudo tar -xvf dropbox-lnx.x86_64-1.5.36.tar.gz
sudo rm -rf dropbox-lnx.x86_64-1.5.36.tar.gz
  

(опять же, используйте имя загруженного файла. Не забудьте расширение.)

Хорошо, проверьте, как называется извлеченная папка:

  лс -а
  

вы получите что-то вроде этого:

  [email protected]:/opt$ ls -a
... .dropbox-расстояние
Джеймс@james-OptiPlex-GX620:/opt$
  

Хорошо, в нашем примере мы установили Dropbox, и единственная папка там называется .dropbox-dist . Вероятно, это та папка, которую мы хотим, поэтому подключите ее к следующему шагу (добавьте / в конец, так как это папка):

  sudo chmod 777 .dropbox-dist/
  

Хорошо, теперь он помечен как исполняемый, поэтому пришло время создать символическую ссылку (это то, что позволяет запускать его из Терминала):

  sudo ln -s /opt/.dropbox-dist//usr/bin/dropbox
  

ПРИМЕЧАНИЕ: это sudo ln -s /opt/{ИМЯ_ПАПКИ}/ /usr/bin/{ИМЯ_ПРОГРАММЫ} !!! Убедитесь, что {ИМЯ_ПРОГРАММЫ} заменено на упрощенную версию имени программы в нижнем регистре (например, для Firefox Nightly введите firefox-nightly ; для сервера uTorrent введите utserver . Что бы вы ни ввели здесь будет командой, которую вы используете всякий раз, когда запускаете программу из Терминала.Думайте о /usr/bin/ как о переменной PATH в системах Windows.)

Хорошо, все готово. Теперь программа установлена ​​и запускается из Терминала.
Что это? Вы говорите, что хотите запустить его из лаунчера, И хотите, чтобы у него был значок? Без проблем!

Эта часть довольно проста:

  gksu gedit /usr/share/applications/dropbox.desktop
  

ПРИМЕЧАНИЕ. Если вы устанавливаете НАД предыдущей установкой, используйте ls -a /usr/share/applications и найдите уже существующий файл .desktop. Вместо этого вставьте имя этого файла.

Теперь вы создаете значок. Вот хороший шаблон; отредактируйте его соответствующим образом.

  [Вход с рабочего стола]
Версия=1.0
Name=Firefox Nightly
Комментарий=просматривать всемирную паутину
GenericName=Веб-браузер
Ключевые слова=Интернет;WWW;Браузер;Интернет;Проводник
Exec=firefox-ночной
Терминал=ложь
X-MultipleArgs=false
Тип = Приложение
Icon=/opt/firefox/icons/mozicon128.png
Категории=GNOME;GTK;Сеть;Веб-браузер;
MimeType=text/html;text/xml;application/xhtml+xml;application/xml;application/rss+xml;application/rdf+xml;image/gif;image/jpeg;image/png;x-схема-обработчик/ http;x-схема-обработчик/https;x-схема-обработчик/ftp;x-схема-обработчик/chrome;видео/webm;application/x-xpinstall;
Уведомление о запуске=истина
Действия=НовоеОкно;

[Действие рабочего стола NewWindow]
Имя=Открыть новое окно
Exec=firefox-nightly-новое окно
ТолькоШоуИн=Единство;
  

Возможно, вы захотите полностью отключить параметр MimeType.Это может быть очень плохо, если вы этого не сделаете.

Теперь нажмите «Сохранить», закройте его, и вы в деле!

Блюз большой дороги

Сегодняшнее шоу — вторая часть многосерийной серии, вдохновленной моим приятелем Акселем Кюстнером, который подружился с Большим Джо в подростковом возрасте, когда Джо был в Германии, а позже провел с ним довольно много времени в Штатах.Аксель много часов записывал интервью и записи Большого Джо между 1973 и 1980 годами, которыми он поделился со мной. Удивительная жизнь, Джо всех знал и везде был; есть истории о таких блюзменах, как Джейберд Коулман, Чарли Паттон, Слепой Лемон Джефферсон, Лид Белли, Пити Уитстроу, рассказы о том, как он провел время в Анголе и Грейстоуне, о похищении гангстерами, об игре на лесопилках и в лагерях на дамбах, о его бесчисленных сессиях звукозаписи и многом другом. . Это рассказ очевидца о 60-летней истории блюза, который трудно понять.Сегодняшнее шоу отмечает 87-летие почти с того дня, когда Джо дебютировал в записи для Bluebird, и большая часть шоу посвящена его записям 30-х и 40-х годов. Мы также слышим некоторых артистов, которые иллюстрируют музыку, которая звучала, когда Джо только начинал, и, возможно, повлияла на него. Для этой серии шоу Аксель призвал меня связаться с теми, кто знал Джо. В сегодняшней программе мы услышим от Дэвида Эванса, который брал интервью у Джо и видел его на протяжении многих лет, а также дает некоторые исторические сведения о карьере Джо и его влиянии.В следующих сегментах мы услышим от самого Акселя, Чарли Масселуайта, Джорджа Митчелла и Джайлза Окли, которые записывали Джо для BBC. Кроме того, мы публикуем несколько выпущенных и неизданных записей, сделанных Акселем в 70-х годах. Заметки о сегодняшнем шоу были предоставлены Акселем.

Оглядываясь спустя 87 лет на те две сессии 1935 года в Чикаго для Bluebird Records, понедельник, 25 февраля и четверг, октябрь.31., количество блюзовых талантов, присутствовавших в студии, просто захватывает дух. Я думаю, что 25 февраля 1935 года было особенно интересным и важным в истории коммерческого блюза. Именно в этот день Джо Уильямс сделал свою первую запись, а Лерой Карр — последнюю. Для Большого Джо Уильямса это было началом карьеры звукозаписи, которая продолжалась до его смерти 17 декабря 1982 года. Пианист и певец Лерой Карр (род. 27 марта 1904 года) впервые записал в июне 1928 года и вместе со своим партнером, блестящий гитарист Скрэппер Блэквелл (1904–1962), они сформировали один из лучших и самых успешных дуэтов в истории блюза — c.150 названий, которые они записали, ясно указывают на это. Самой последней записью, которую Карр сделал в тот день, было сольное выступление под названием «Six Cold Feet in The Ground». Почти ровно через 2 месяца, 29 апреля 1935 года, Карр умер от алкоголизма. Для Большого Джо Уильямса 31 октября 1935 года его песня «Малыш, пожалуйста, не уходи» была впервые обработана воском. Это оказалось одним из самых устойчивых стандартов в истории блюза. На веб-сайте SecondHandSongs перечислены более 190 версий, записанных с 1935 года, от малоизвестных блюзовых исполнителей, таких как Tampa Kid, Baby Doo (Caston), Pinetop Slim, до знаменитых Lightnin’ Hopkins, John Lee Hooker, Muddy Waters и таких рок-исполнителей, как Dion, Gary Glitter. , AC/DC, Том Петти, MC5, The Doors, Van Morrison & Them, Тед Ньюджент и многие другие.

10 октября 1993 года Генри Таунсенд (1909–2006) дал интервью Арту Шуне для своей радиопрограммы «Два для блюза», транслировавшейся на WORT-FM в Мэдисоне, штат Висконсин (опубликовано в Blues & Rhythm No. 356, февраль 2021 г.) и сделал интересное заявление об этой песне: «’Baby Please Don’t Go’, он и я оба в ней.Мы с ним играли и обменивались стихами. Я помог написать это, но не получил за это признания. Я был там — вроде как сочинил это перед тем, как мы вошли внутрь. Большой Джо не умел читать. поэтому мы не могли его записать, но у него была хорошая память. Мы сделали это примерно 50-50 с этим». Нет никаких доказательств того, что какая-либо запись этой мелодии, где они оба играли вместе на тех сессиях 1935 года, действительно существует.

Чтобы представить эти два захватывающих дня в перспективе, я составил эту дискографию в соответствии с матричными числами.Подробности о сессиях для отдельных артистов можно найти на замечательном веб-сайте Stefan Wirz American Music.

Чикаго, понедельник, 25 февраля 1935 года:

WALTER DAVIS (85479 – 85486) (8 дорожек)
JOE WILLIAMS (85487 – 85492) (6 дорожек)
HENRY TOWNSEND (85493 / 85494) (2 дорожки)
LEROY CARR (85495 – 85498) (48 дорожек) 9122 BLACKWELL (85499) (1 дорожка)
SCRAPPER BLACKWELL (85512) (1 дорожка)
LEROY CARR (85513 – 85516) (4 дорожки)
(Сессии CARR / BLACKWELL были разделены между 2 соседними студиями, отсюда и пробел в матричных номерах ).

Чикаго, четверг, 31 октября 1935 г.:

CASEY BILL (WELDON) (96220 – 96225) (6 дорожек)
MEMPHIS MINNIE (96226 – 96229) (4 дорожки)
BIG BILL (BROONZY) (96230 – 96233) (4 дорожки)
WALTER DAVIS (96234 – 96239) (6 дорожек)
OTTO VIRGIAL (96240 – 96243) (4 дорожки)
JOE WILLIAMS’ WASHBOARD BLUES SINGERS (96244 – 96247) (4 дорожки)
CHASEY COLLINS (96248 / 96249) (2 дорожки)

Оригинальные диски Джо Уильямса Bluebird на 78 оборотов в минуту с этих двух сессий сегодня чрезвычайно редки — сообщается, что лишь от 5 до 10 копий каждого из них попали в руки нескольких счастливых коллекционеров.

27 марта 1941 года Джо Уильямс написал мелодию «Crawlin’ King Snake», которая стала еще одним классическим стандартом блюза. Певец и гитарист Тони Холлинз из Кларксдейла, штат Миссисипи, записал эту песню дважды: 3 июня 1941 года в Чикаго для OKeh и 13 октября 1951 года для Decca. Джон Ли Хукер впервые записал эту мелодию в Детройте 18 февраля 1949 года для Modern Records. Он использовал версию Холлинза как источник вдохновения.В наши дни эту песню обычно ошибочно приписывают Хукеру. Как и «Baby Please Don’t Go», «Crawlin’ King Snake» исполняли каверы многих исполнителей, от Howlin’ Wolf, Muddy Waters и Buddy Guy до малоизвестных Wilbert Jenkins, Blind Jim Brewer или James «Son» Thomas и знаменитых Рокеры, такие как Питер Грин, Эрик Бердон, Джордж Торогуд, The Doors и совсем недавно, в 2021 году, The Black Keyes.

Самый первый полноценный альбом, посвященный Большому Джо Уильямсу начала 1935 – 1941 годов, вышел в Англии в 1970 году на лейбле RCA International (Camden).Это была серия из 6 пластинок с записями Bluebird & Victor. Пластинки были спродюсированы Нилом Славеном, который также написал отличные аннотации к альбому. Материал для этих записей был взят у оригинальных мастеров, и качество звука было просто превосходным. Эта серия отличалась отличной графикой на обложке и имела бюджетную цену:

УОЛТЕР ДЭВИС – ДУМАЮ, ВАМ НУЖЕН ВЫСТРЕЛ (INT 1085)
БОЛЬШОЙ ДЖО УИЛЬЯМС – CRAWLIN’ KING SNAKE (INT 1087)
SONNY BOY WILLIAMSON – BLUEBIRD BLUES (INT 1088) ЛЮК ДЖОРДАН / BLIND WILLIE McTELL / MEMPHIS JUG BAND / JAMES RACHEL / CLIFFORD GIBSON /CANNON’S JUG STOMPERS / WALTER DAVIS / ELIJAH JONES / JOE WILLIAMS (NOT BIG JOE!) / SONNY BOY WILLIAMSON) (INT 1175)
DOCTOR CLAYBUTTON & HIS (SUNNYLAND SLIM) – PEARL HARBOR BLUES (INT 1176)
JAZZ GILLUM – ВЫ ДОЛЖНЫ ПОЖАТЬ ЧТО ПОСЕВАЕТЕ (INT 1177)

На LP Big Joe вошли только 3 трека с его сессий 1935 года, но его полные сессии 1937 и 1941 годов.

Ханибой Эдвардс (1915–2011) объединился с Большим Джо Уильямсом, когда ему было 17 лет, в 1932 году. Delta Bluesman Honeyboy Edwards» (1997) очень интересны и занимательны, и они дают хорошее представление о звучании записей Big Joe 1935 года: «Это было незадолго до Рождества в 1932 году.А Большой Джо Уильямс играл на танцах Черной Рози. Тогда Джо был всего лишь бродягой, бегавшим по улицам. Я пошел к Рози, и там он играл. Ему было за тридцать, на шее у него был красный носовой платок, и он играл на маленькой гитаре Stella с жемчужным грифом; он играл Блюз. Он играл «Highway 49», а я просто стоял и смотрел на него. Я никогда не слышал, чтобы мужчина так играл блюз! Я и Джо прожили вместе около восьми или девяти месяцев. Джо Уильямс играл на высоком испанском языке с каподастром на своей гитаре, а меня сбивал с ног в ми-бемоль в открытой тональности.Когда я играл в открытой тональности за этим высоким испанским, это звучало так же, как бас за мандолиной или что-то в этом роде из-за его высокого тона с каподастром. И у меня низкий тон в тональности ми, но это та же тональность. Девять струн, у него всегда были эти девять струн на его гитаре. Это то, что он придумал сам. Он просверлил отверстия в верхней части грифа гитары и сделал себе девятиструнную гитару. Так он играл все время. Он играл «Брат Джеймс», все эти старые номера.«Брат Джеймс», «Шоссе 49», «Стопка долларов. «Stack O’Dollars, Keep a-Knockin’, вы не можете войти. Stack O’Dollars, вы не можете войти». «Малыш, пожалуйста, не уходи», «Коровий блюз». Он сыграл все эти старые номера. Некоторые песни он сочинил, а я просто играл на второй гитаре позади него. Он просто сочинял песни на месте, и это тоже были хорошие песни. И мы получили довольно хорошо; мы заработали».

Я добавляю к эссе Акселя дополнительный материал, который дает некоторое представление о музыке, которую Большой Джо, возможно, слышал и на которую оказал влияние.К счастью, Конгресс Библиотеки сделал захватывающие полевые записи того периода. Ливингстон, штат Алабама, находится примерно в 60 милях от дома Большого Джо в Кроуфорде, штат Миссисипи, и мы проигрываем записи, сделанные там, чтобы дать представление о музыке, которую Большой Джо, возможно, слышал в годы своего становления. В 1940 году Джон Ломакс записал Веру Холл, Ричарда Амерсона и Тома Белла. Ричард Амерсон родился в 1893 году недалеко от Самтервилля, штат Алабама. Стиль пения Амерсона оказал значительное влияние на Веру Холл, и Ломакс считал его своим величайшим открытием.Он был широко записан Ломаксом в 1937 и 1940 годах.

Во время этих сессий Вера Холл дважды спела «Another Man Done» на записывающую машину Джона Ломакса. В книге Стивена Уэйда « The Beautiful Music All Around Us » он пишет: «Когда Вера записывала «Another Man Done», она сказала Джону Ломаксу, что научилась этому у своего мужа, играющего на гитаре. … Когда писатель-коллекционер Гарольд Курландер приехал в Ливингстон в феврале 1950 года, он записал как Веру, поющую «Другой мужчина готов», так и кого-то, кого она знала: Уилли Тернера, двадцатисемилетнего заключенного в лагере Ливингстона.Вместе с двумя своими сокамерниками он спел и записал «Now Your Man Done Gone», пьесу, которую они обычно пели в банде окружных дорог. … За два дня до того, как Курландер записал Уилли Тернера в Кэмп Ливингстон, он остановился в сорока милях от него в Марионе, штат Миссисипи. Там он записал певицу, названную в его записях «только Корой, которая спела «Baby Please Don’t Go»… ту же самую песню, но с некоторыми отличиями в тексте». Эта песня была впервые записана на коммерческой основе Big Joe в 1935 году. Эти песни «вписываются в большую группу песен, в которую входят «I’m Alabama Bound», «Don’t Ease Me In», «Don’t Leave Me Here» и т. д. и «Старейшина Грин в городе».Мы крутим песню Papa Harvey Hull & Long «Cleve» Reed «Don’t You Leave Me Here», коммерческую запись, выпущенную в 1927 году.

Другие артисты, представленные сегодня, включают Чарли Паттона, The Birmingham Jug Band и Уолтера Дэвиса, которого Джо поддержал в 1935 году. Большой Джо и Чарли Паттон вместе играли в Дельте. Эти двое играли за деревенским ужином, когда стали свидетелями ужасного убийства между двумя игроками. Сегодня мы играем «Elder Greene Blues» Паттона, который очень похож на «Alabama Bound», «Don’t Leave Me Here» и «Baby Please Don’t Go».Мы слышим от The Birmingham Jug Band, которая записала восемь грубых и готовых сторон 11 декабря 1930 года. Большой Джо заявил, что является членом группы, и перечислил персонал, который использовался в дискографии Blues and Gospel Records 1890-1943 .

Аксель хочет поблагодарить звукорежиссера Тома Спеттера за отличную работу по оцифровке его старых кассет с неизданными записями, а также своего старого приятеля по блюзу Винна Фрейера за то, что он откопал регистрационные карточки времен Второй мировой войны для Большого Джо Уильямса и Джесси Логана.Их работа всегда высоко ценится!

Теги: Аксель Кюстнер, Большой Джо Уильямс, Birmingham Jug Band, Blind Jesse Harris, Charlie Patton, Chasey Collins, David Evans, Honey Boy Edwards, Napoleon Strickland, Papa Harvey Hull & Long ‘Cleve’ Reed, Richard Ameson, Tom Bell, Вера Холл, Уолтер Дэвис, Уош Деннис и Чарли Симс